Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء اتحاد SSGCID. يتم تحقيق أهداف SSGCID المحتمل بفضل جهود هائلة من جميع أعضاء الفريق في Emerald بيو. وقد تم تمويل هذا البحث في إطار العقد الاتحادي رقم HHSN272200700057C من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية، والمعاهد الوطنية للصحة ووزارة الصحة والخدمات البشرية.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

الكتاب والعاملين من الزمرد الحيوية، وشركة

المعالجة المتوازية متعددة الهدف هيكل القائم على تصميم الأدوية تلعب دورا هاما في اكتشاف المخدرات. ويكرس SSGCID إلى تزويد المجتمع العلمي مع هياكل البروتين ثلاثة أبعاد من مسببات الأمراض المعدية فئة AC. وجعل هذه المعلومات متاحة على نطاق واسع الهيكلية تخدم في نهاية المطاف إلى تسريع هيكل القائم على تصميم الأدوية. الخطوة الأولى الحاسمة لنهج MTPP هو تصميم بناء. بنيات متعددة من كل البروتين المستهدف يزيد من احتمال تحديد هيكل ناجح وزيادة التحول. فلا مناص من أن بعض بنيات البروتين ستفشل خلال مراحل خط الانابيب. تنفيذ أسلوب الاستنساخ الأنابيب يعتمد أسلوب MTPP من خلال السماح للتوليد العديد من يبني في شكل 96-جيدا دون العمل خطوات تنقية مكثفة. الاقتران استنساخ الأنابيب مع القدرة على تحليل بروتين تعبير في نفس شكل 96-جيدا (الفرجار مختبررقاقة 90) يعجل مزيد من التدفق الإجمالي. الاقتران من هذه الأساليب يسمح لسرعة تحديد بنيات التي تنتج بروتين قابل للذوبان والتي تضمن نجاح إنتاج البروتين على نطاق واسع وتنقية. أحد الجوانب الأساسية لنجاح MTPP عالية الإنتاجية هو صانع البروتين (رقم براءة الاختراع الأمريكية 6818060، الزمرد BIO) الصك. صانع البروتين هو مواز نظام السائل اللوني 24 قناة وضعت خصيصا لتعزيز كفاءة إنتاج بروتين عالية الإنتاجية والهيكلية المتعلقة الجيني التطبيقات البحثية خط أنابيب. باستخدام بروتوكول سبق وصفها لصانع البروتين، ومزايا واضحة في المقارنة إلى نظام FPLC سطر واحد. ويمكن لشخص واحد تنقية ما يصل إلى 48 هدفا في نفس الوقت ضمن فترة ثماني ساعات. في المقابل، يمكن لشخص واحد باستخدام نظام FPLC سطر واحد يطهر فقط كحد أقصى من أربعة أهداف ضمن نفس الإطار الزمني. مستويات عالية من النقاء لكل هدفتحقق مع صانع البروتين هي عامل حاسم في نجاح متزايد في وقت لاحق من البلورات البروتينية لتحليل هيكل. القيود واستكشاف الأخطاء وإصلاحها حل هياكل ثلاثية الأبعاد بواسطة البلورات بالأشعة السينية هو جهد متعدد نظموا العديد من التحديات، واحدة منها هو عدم القدرة على الحصول على كميات كبيرة من البروتين الهدف قابل للذوبان. استراتيجية واحدة والتي يمكن تنفيذها للتغلب على مشكلة الذوبان هو استخدام مضيف التعبير البديلة مثل E. الخلايا القولونية غير قادرة على أداء العديد من حقيقية النواة التعديلات بعد متعدية الهامة. التعبير في مختلف الخميرة، وخطوط الخلية الحشرات والثدييات التي هي قادرة على أداء هذه التعديلات بعد متعدية غالبا ما تكون بديلة مناسبة. يتم التعبير عن البروتينات المستهدفة في بعض الأحيان ولكن غير قابلة للذوبان تماما في ظروف تحلل القياسية. صانع البروتين يمكن أن يكون مصدرا قيما للاختبار السريع للأوضاع تحلل الخلايا البديلةكما هو موضح في سميث وآخرون. 2011 13. هذه الاستراتيجية غالبا ما يكون ضروريا للحفاظ على الاهداف المتحركة عبر خط الانابيب. في أي خط أنابيب الجينوميات الهيكلي، وبروتوكولات موحدة قد لا تكون مناسبة لكل الهدف الذي يأتي من خلال خط أنابيب، وربما بحاجة إلى أهداف التحسين الفردية. على سبيل المثال، اخترنا لاستخدام 20٪ جلايكول الإثيلين لكل cryoprotectant. في الحالات أن هذا الشرط غير مناسب، قد cryoprotectants أو تركيزات البديل يجب أن يتم اختباره. ونظرا للطبيعة الفريدة من كل هدف البروتين الفردية، ومعدل منظم وخطوة لا يمكن التنبؤ بها في تحديد هيكل هو التبلور. للإزاحة خط أنابيب MTPP نسبة النجاح منخفضة عادة من بلورة البروتين مع التحسين من شاشات مصفوفة متفرق الأولي. كل الكريستال الأولي ضرب من المتاحة تجاريا شاشات مصفوفة متناثر هو الأمثل مع مزيد من منشئ E-الشاشة (الزمرد BIO). تم تصميم الشاشة الأمثل عس اوند حالة ضرب الكريستال الأولية، تغيير تركيزات من المخازن المؤقتة، وأملاح، ومواد مضافة. شاشات الأمثل ناجحة تسفر عن بلورات المناسبة للدراسة الحيود وتحديد هيكل. برنامج علم الجينوم الهيكلي طرح من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID) يوفر التمويل لالزمرد الحيوية وثلاث مؤسسات شمال غرب المحيط الهادئ الآخرين الذين هم معا SSGCID (الزمرد بيو، SeattleBiomed، جامعة واشنطن والمختبر الوطني شمال غرب المحيط الهادئ) . وقد تم اختيار كل عضو من أعضاء الكونسورتيوم لخبرتهم في تطبيق تكنولوجيات للدولة من بين الفن المطلوبة لإنجاز أهداف البرنامج الجينوميات الهيكلية المعدية. حتى الآن، قد أودعت SSGCID 461 هياكل في الترتيب PDB على أنها سابع أكبر مساهم في العالم، وفي عام 2011، والأكثر إنتاجية. وتقدم البروتوكولات والمنهجيات من SSGCID بقصد الاستفادة منالمجتمع العلمي وإدامة البحوث من الأمراض المعدية.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

تفشي جائحة من سلالات الأنفلونزا شديدة الضراوة يمكن أن يسبب الاعتلال والوفيات على نطاق واسع في المجتمعات البشرية في جميع أنحاء العالم. في الولايات المتحدة وحدها، هي سبب ما معدله 41،400 حالة وفاة و1860000 المستشفيات عن طريق العدوى فيروس الإنفلونزا كل عام 1. وقد تم ربط الطفرات نقطة في البلمرة الأساسية البروتين الوحيدات 2 (PB2) إلى التكيف من العدوى الفيروسية في البشر 2. وقد كشفت النتائج المستخلصة من هذه الدراسات أهمية بيولوجية من PB2 كعامل الفوعة، وبالتالي إبراز إمكاناتها كهدف العقاقير المضادة للفيروسات. برنامج علم الجينوم الهيكلي طرح من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID) يوفر التمويل لالزمرد الحيوية وثلاث مؤسسات شمال غرب المحيط الهادئ الأخرى التي تشكل معا مركز سياتل الجينوم الإنشائية للأمراض المعدية (SSGCID). ويكرس SSGCID إلى تزويد المجتمع العلمي مع ثلاث،هياكل البروتين الأبعاد (ه) من مسببات الأمراض المعدية فئة AC. مما يجعل هذه المعلومات متاحة الهيكلية للمجتمع العلمي يعمل على تسريع هيكل القائم على تصميم الأدوية. هيكل القائم على تصميم الأدوية تلعب دورا هاما في تطوير العقاقير. متابعة أهداف متعددة في نفس الوقت يزيد كثيرا من فرص النجاح لاكتشاف قيادة جديدة من خلال استهداف طريقا أو عائلة بروتين كامل. وقد وضعت الزمرد بيو خط أنابيب عالية الإنتاجية، متعدد الاهداف المعالجة المتوازية (MTPP) لتحديد الجينات إلى هيكل لدعم الكونسورتيوم. نحن هنا وصف البروتوكولات المستخدمة لتحديد بنية الوحيدات PB2 من أربعة إنفلونزا A سلالات مختلفة.

توضح النتائج التالية النتائج المتوقعة من البروتوكول وصفها، وفي حالة PB2، نتائج المرصودة. باستخدام الملحن جين، تم تصميم خمسة الهدف كامل طول تسلسل الأحماض الأمينية للبوليميريز فيروس الانفلونزا PB2 الوحيدات (الشكل 2). وكان تسلسل PB2 تترجم مرة أخرى وتعرض للكثير من الخطوات الهندسة 3، مما أدى إلى كودون تسلسل منسقة الأمثل للتعبير في E. القولونية. من المنتجات iPCR (الشكل 3B)، أي ما مجموعه أربعة وثلاثين بنيات تم استنساخ بنجاح إلى تعديل pET28 نظام ناقل 10 مع N-6X صاحب محطة، SMT العلامة الانصهار باستخدام الأنابيب الاستنساخ 3 كما هو مبين في الشكل 3A. ويرد موجز لسير العمل استنساخ في الشكل 4. بعد استنساخ ناجحة، تم اختبار بروتين تعبير الصغيرة الحجم من كل بناء في BL21 (DE3) E.الخلايا القولونية. وقد نمت الخلايا في المتوسط ​​TB تستكمل مع Novagen بين عشية وضحاها اكسبرس 1 حبة متوسطة الحجم (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة) لمدة 48 ساعة عند 20 درجة مئوية في حاضنة تهتز مجموعة في 220 دورة في الدقيقة. بعد النمو، وكان حصاد الخلايا واختبارها للتعبير البروتين للذوبان باستخدام الاستشراد الشعرية مع الفرجار LabChip 90. أربعة عشر دولة من الدول الأربع والثلاثين PB2 بنيات أدى إلى ذوبان البروتين الهدف ودخلت التخمير على نطاق واسع. وقد نمت الثقافات على نطاق واسع من كل بناء في المتوسطة TB تستكمل مع ليلة وضحاها اكسبرس 1 حبة متوسطة الحجم Novagen وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد النمو، وكان حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتخزينها في -80 درجة مئوية. وأكد تعبير البروتين على نطاق واسع من كل ثقافة عبر تحليل SDS-PAGE (الشكل 5) قبل الشروع في تنقية واسعة النطاق. تم استخدام الة لصنع بروتين لإجراء تنقية مواز من أربعة عشر بنيات PB2. ولست] توضيح من آلتم تشغيل أربعة عشر لتر يبني من خلال عمود النيكل وكلاب. بعد تحديد أي الكسور الواردة البروتين المستهدف بواسطة SDS-PAGE، وكان يتم تجميع الكسور المقابلة لكل عينة وتم تحديد تركيز كل من قبل A القراءة 280. وقد أجريت إزالة للعلامة صاحب، SMT 6X عن طريق إضافة ULP1 تليها غسيل الكلى بين عشية وضحاها وعمود النيكل الثاني. وقد أجريت تأكيدا لإزالة زوائد له، SMT بواسطة SDS-PAGE (الشكل 6)، وتركزت كل عينة مع 10 كيلو دالتون أنبوب الطرد المركزي Amicon الترا. بعد تركيز باستخدام أنابيب الطرد المركزي المركزي Amicon الترا، تم تشغيل كل عينة على عمود التحجيم لتحقيق نقاء البلورات. وأجري تركيز الثانية لزيادة تركيز البروتين إلى المستوى اللازم لتبلور. وتنقيته بنجاح كل أربعة عشر بنيات ودخلت حيز المحاكمات التبلور. وقد بدأ تبلور من خلال الذوبان الاب سابقاأوزين البروتين. تم إجراء تبلور في غرفة التحكم في المناخ في 16 ° C مع لوحات مصممة خصيصا (الزمرد بيو) للجلوس قطرة بخار نشرها (الشكل 7). أجري الفحص الأولي مع أربع شاشات متناثر مصفوفة؛ JCSG +، حلف، معالج كامل، وCryoFull (الزمرد بيو)، بعد أن استراتيجية نيومان الموسعة. وكان 0.4 ميكرولتر من محلول البروتين ثم يخلط مع 0.4 ميكرولتر من crystallant (أو حل خزان) من الخزان المناظرة باستخدام 96-جيدا المدمجة لوحات تبلور جونيور (الزمرد BIO). من أربعة عشر عينات تنقيته تسعة منهم أسفرت عن بلورات المناسبة للدراسة حيود (الشكل 8). تم جمع مجموعة بيانات حيود في المنزل على خمسة من تسعة بنيات تبلورت في النحاس Kα الطول الموجي باستخدام Rigaku SUPERBRIGHT FR-E + الدورية لل-الأنود مولد الأشعة السينية مجهزة الأوسميك VariMax HF البصريات وزحل 944 + CCD كاشف (الشكل 9 ). تم معالجة كل مجموعة بيانات مع XDS / معالج xscale 4 &lt;<html> / سوب&gt; وتدرج إلى التوصل إلى حل نهائي. أجريت محاولات حل عن طريق استبدال الهياكل الجزيئية خارجا مع فيزر 5 من CCP4 جناح 7. وتم الحصول على النماذج النهائية بعد التنقيح في REFMAC 7 و إعادة بناء دليل مع الطير المائي 11. تم تقييم الهياكل وتصحيحه للهندسة واللياقة البدنية مع MolProbity 9. تم تحديد ما مجموعه أربعة هياكل فرعية PB2 (الشكل 10) وأودعت في PDB. ويوضح الشكل (11) والنتيجة العامة في كل مرحلة في خط أنابيب MTPP. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> الشكل 1. نظرة عامة على SSGCID مسار الجين إلى بنية للمعالجة المتوازية متعدد الاهداف في Emerald بيو. <html> محتوى &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> الشكل 2. عارض المحاذاة والبروتين كونستركت وحدة التصميم في مجال البرمجيات الملحن الجينات. قاعدة الأحماض الأمينية بناء الهدف هو مبين باللون الأخضر (إطار الأوسط) وتظهر بنية truncations الموجهة من بنيات بديلة في الذهب (النافذة السفلى). ويرد محاذاة متعددة انفلونزا الفيروسية PB2 متواليات مقارنة تسلسل وعناصر البنية الثانوية من المجال C-محطة من 3CW4 PDBID. المعرفة من بنية المجال وعناصر هيكل الثانوي يسمح truncations N-محطة التي سيتم اختيارها ضمن الجينات الملحن وحدة التصميم بالنقر بزر الماوس الأيمن على بقايا الأحماض الأمينية المطلوبة. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . ithin الصفحات = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 3A" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3a.jpg" /> الشكل 3A. ويتضح الأنابيب الاستنساخ حيث يتم تضخيمه إدراج الجينات الاصطناعية (البرتقالي) من خلال تصميمه إلى الأمام (خطوط حمراء والبرتقالي) وعكس (خطوط البرتقالي والأزرق) الاشعال لتوليد إدراج مادة PCR. يتم تضخيمه وناقلات التعبير مع خطوط الاتجاه المعاكس (الأحمر والأسود ) وإلى الأمام (خطوط الأزرق والأسود) الاشعال لتوليد PCR ناقلات المواد. تسلسل محطة iPCR منتجات مكملة لتسلسل محطة من المنتجات vPCR (أحمر من iPCR يكمل الأحمر والأزرق vPCR من iPCR يكمل الأزرق من vPCR). وهذا يسمح للiPCR وvPCR المنتجات ليصلب لتشكيل البلازميدات التي يتم تكرارها على التحول إلى مضيف BL21 (DE3) E. المختصة كيميائيا الخلايا القولونية. <img alt="الشكل 3B" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> 3B الشكل. الاغاروز تحليل هلام من iPCR المنتج<html> يمكن أن ينظر إليها TS من الوحيدات PB2. الفشل iPCR كما العصابات خافت أو ملطخ، في حين يتم تمثيل المنتجات iPCR الناجحة التي قام بها عصابات قوية. عموما يمكن جودة المنتج iPCR تكون مرتبطة مع نجاح الاستنساخ. علامات الوزن الجزيئي في kiloDaltons. ويرد الرقم من ريمون وآخرون.، 2011 12. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> الشكل 4. أجريت خطوات هندسة الجينات من الهدف PB2 البروتينات باستخدام البرمجيات الملحن الجينات. بعد إنشاء تسلسل المهندسة الحمض النووي لكل هدف، وقد صممت 6-7 بنيات بروتين بديلة لكل منها. أدت المعالجة المتوازية متعددة الهدف في الخطوات الأولية لتصميم الجينات والاستنساخ في 34 يبني، 14 منها كانت أهداف قابلة للحياة التي أنتجت بروتينات قابلة للذوبان في E. القولونية. <html> إعادة 5 &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; الشكل 5. ممثل تحليل SDS-PAGE التخمر نطاق واسع تظهر بروتين تعبير قوي (الحجم المتوقع من 25.76 كيلو دالتون)، ما يقرب من 50٪ قابل للذوبان (حارة 4)، وحوالي 50٪ من الانقسام العلامة 6X له في فريق الإدارة العليا من بروتين مزال (لين 7). <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> الشكل (6). النتائج SDS-PAGE لمدة ثلاث بنيات من الوحيدات PB2 البلمرة لين 1، الواسمات الجزيئية الوزن (المسمى على اليسار في كيلو دالتون)؛. الممرات 2 و 6، و 10، والبروتين تجميع من النيكل 1 عمود؛ الحارات 3 و 7 و 11، من خلال تدفق البروتين المشقوق في المخزن A من النيكل 2؛ الممرات 4، 8، و 12، وإزالة علامة 6X له في فريق الإدارة العليا في المخزن B من النيكل 2. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; الرقم 7. A التخطيطي من بخار نشر بواسطة الأسلوب قطرة الجلوس. الأسلوب قطرة الجلوس لبلورة البروتين يندرج تحت فئة من بخار نشرها. هذا الأسلوب ينطوي على عينة تنقيته من البروتين ومرسب لكي تتوازن مع خزان أكبر تتضمن شروطا مماثلة في تركيز أعلى. كما يبخر الماء من عينة البروتين والتحويلات إلى الخزان، يزيد تركيز مرسب إلى المستوى الأمثل لبلورة البروتين. <img alt="الرقم 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> الرقم 8. الكريستال بروتين من البلمرة PB2 الوحيدات من سلالة من فيروس الانفلونزا. <img alt="الرقم 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> الشكل 9. الأشعة السينية صورة الحيود من البلمرة PB2 الوحيدات منسلالة من فيروس الأنفلونزا. <img alt="الرقم 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> الشكل 10. المخططات الشريط من الجزيئات في وحدة غير متكافئة البلورات من 4 PB2 الهياكل. الهياكل الثانوية الملونة في نمط قوس قزح مع رموز PDB المقابلة. (أ) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (ب) 3KHW (A / المكسيك / InDRE4487/2009/H1N1) (ج) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (د) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="الرقم 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> الشكل 11. تحليل نتائج لإنفلونزا PB2 الأهداف وفقا للأساليب وصفها. ومتطوره.ويتضح E خط أنابيب تقرير في خمس خطوات: الاستنساخ، قابلية الذوبان، وتنقية، وتبلور هيكل المصير.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

هيكل القائم على تصميم الأدوية تلعب دورا هاما في تطوير العقاقير. متابعة أهداف متعددة في نفس الوقت يزيد كثيرا من فرص النجاح لاكتشاف الرصاص. يسلط الضوء على المقالة التالية كيفية مركز سياتل الجينوم الإنشائية للأمراض المعدية يستخدم نهجا متعدد الاهداف لتحديد الجينات إلى هيكل إنفلونزا PB2 A الوحيدات.

متعدد الاهداف نهج المعالجة المتوازية لتحديد الجينات إلى هيكل البلمرة الأنفلونزا PB2 الوحدة الفرعية

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

نوع التحاليل الكمية للجميع الأنفلونزا من Hemagglutinins الفيروسية وNeuraminidases باستخدام الاجسام المضادة العالمي في فتحة بسيطة فحوصات لطخة

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

إدارة الأنف المؤتلف لقاحات الأنفلونزا في همي ماوس نماذج لدراسة الأغشية المخاطية الحصانة

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

الأنف المسحات لمكافحة الأنفلونزا A الكشف عن الفيروسات وعزل من الخنازير

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

والمنمنمة غليكان ميكروأري الفحص لتقييم الطمع وخصوصية الأنفلونزا من الفيروسات Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...