Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke alle medlemmer af SSGCID konsortiet. Achievement of the SSGCID mål er gjort mulig ved den enorme indsats fra alle teammedlemmer på Emerald Bio. Denne forskning blev finansieret under Federal Kontrakt nr. HHSN272200700057C fra National Institute of Allergy og infektionssygdomme, National Institutes of Health og Institut for Sundhed og Human Services.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

Forfatterne er ansat i Emerald Bio, Inc.

Multi-Target Parallel Processing Struktur-baserede drug design spiller en vigtig rolle inden for lægemiddelforskning. Den SSGCID er dedikeret til at levere det videnskabelige samfund med tre-dimension protein strukturer fra NIAID kategori AC patogener. Making strukturel information bredt tilgængelige i sidste ende vil tjene til at fremskynde struktur-baseret design af lægemidler. Det første kritiske trin i MTPP tilgang er konstrukt design. Flere konstruktioner af hvert mål protein øger sandsynligheden for vellykket struktur beslutsomhed og øger turnaround. Det er uundgåeligt, at nogle protein konstruktioner vil mislykkes under stadier af rørledningen. Gennemførelse PIPE kloning metode understøtter MTPP metode ved at tillade generering af mange konstruktioner i 96-brønds format uden arbejdsintensive oprensningstrin. Parring PIPE kloning med evnen til at analysere proteinekspression i den samme 96-brønds format (Caliper LabChip 90) yderligere fremskynder den samlede strøm. Parring af disse metoder giver mulighed for hurtig identifikation af konstruktioner, der producerer opløseligt protein, som sørger for succesen af ​​proteinproduktion i stor skala produktion og oprensning. Et væsentligt aspekt til succes MTPP high-throughput er Protein Maker (US Patent No 6.818.060, Emerald Bio) instrument. Protein Maker er en 24-kanals parallel flydende kromatografi system udviklet specielt til at øge effektiviteten af ​​high-throughput proteinproduktion og beslægtede strukturelle genomisk pipeline forskning applikationer. Brug den tidligere beskrevne protokol for Protein Maker, fordelene er indlysende i forhold til en enkelt linje FPLC-system. En enkelt person kan rense op til 48 mål parallelt inden en otte timers periode. I modsætning hertil kan en enkelt person, der bruger en enkelt linje FPLC systemet kun rense højst fire mål inden for samme tidsramme. De høje niveauer af renhed for hvert målopnås med Protein Maker er en kritisk faktor i den senere succes voksende protein krystaller til strukturanalyse. Begrænsninger og fejlfinding Løsning tredimensionale strukturer ved røntgenkrystallografi er en multitrins indsats med mange udfordringer, hvoraf den ene er den manglende evne til at opnå store mængder af opløseligt målprotein. Én strategi, der kan gennemføres for at overvinde opløselighed problem er brugen af en alternativ ekspressionsvært som E. coli-celler er i stand til at udføre adskillige vigtige eukaryote posttranslationelle modifikationer. Ekspression i forskellige gær-, insekt-og mammale cellelinjer, der er i stand til at udføre disse posttranslationelle modifikationer er ofte en egnet alternativ. Target-proteiner er undertiden udtrykkes men helt uopløselig i standard lysis forhold. Protein Maker kan være en værdifuld ressource for hurtig test af alternative cellelysis betingelsersom beskrevet i Smith et al. 2011 13 personer. Denne strategi er ofte nødvendigt at holde målene bevæger sig gennem rørledningen. I alle strukturel genomforskning rørledninger, kan standardiserede protokoller ikke være egnet til alle mål, der kommer gennem rørledningen og mål kan have brug for individuel optimering. For eksempel har vi valgt at bruge 20% ethylenglycol til hver kryobeskyttelsesmiddel. I tilfælde, at denne betingelse ikke er egnet, kan alternative kryobeskyttelsesmidler eller koncentrationer skal testes. På grund af den unikke natur af hvert enkelt protein-target, det hastighedsbegrænsende og uforudsigelige skridt til at afgøre en struktur er krystallisering. De MTPP pipeline opvejer den almindeligt lav succesrate af protein krystallisering med optimering fra de første sparsomme matrix skærme. Hver indledende krystal hit fra kommercielt tilgængelige sparsomme matrix skærme er yderligere optimeret med en E-Screen Builder (Emerald Bio). Optimeringen Skærmen er udformet around tilstand oprindelige krystal hit, ændring af koncentrationerne af de buffere, salte og tilsætningsstoffer. Vellykket optimering skærme giver krystaller egnede til diffraktion undersøgelser og strukturbestemmelse. Den strukturelle genomforskning program lagt frem af Det Nationale Institut for Allergi og Smitsomme Sygdomme (NIAID) yder støtte til Emerald Bio og tre andre Pacific Northwest institutioner, som tilsammen er de SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, University of Washington og Pacific Northwest National Laboratory) . Hvert medlem af konsortiet blev valgt for deres ekspertise i at anvende state-of-the-art teknologier, der kræves for at opnå de mål NIAID strukturelle genomforskning program. Til dato har SSGCID deponeret 461 strukturer i FBF ranking det som den syvende største bidragyder i verden, og i 2011, de fleste den produktive. De protokoller og metoder for SSGCID er forsynet med den hensigt at gavnevidenskabelige samfund og forevige forskningen af ​​smitsomme sygdomme.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

Pandemic udbrud af stærkt virulente influenzastammer kan forårsage omfattende sygelighed og dødelighed i befolkningsgrupper over hele verden. I USA alene, er et gennemsnit af 41.400 dødsfald og 1.860.000 indlæggelser forårsaget af influenza-virus-infektion hvert år 1. Punktmutationer i polymerase basisk protein 2 underenhed (PB2) har været knyttet til tilpasningen af virusinfektion hos mennesker 2. Resultaterne fra sådanne undersøgelser har afsløret den biologiske betydning PB2 som en virulensfaktor, hvilket understreger dens potentiale som et antiviralt lægemiddel mål. Den strukturelle genomforskning program lagt frem af Det Nationale Institut for Allergi og Smitsomme Sygdomme (NIAID) yder støtte til Emerald Bio og tre andre Pacific Northwest institutioner, der tilsammen udgør Seattle Strukturel Genomics Center for smitsomme sygdomme (SSGCID). Den SSGCID er dedikeret til at levere det videnskabelige samfund med three-dimensionelle proteinstrukturer NIAID kategori AC patogener. Realiseringen strukturel information til rådighed for det videnskabelige samfund tjener til at accelerere struktur-baserede drug design. Struktur-baserede drug design spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​lægemidler. Fortsat flere mål parallelt øger chancen for succes for nye lead opdagelse ved at målrette en sti eller en hel protein familien. Emerald Bio har udviklet en high-throughput, multi-target parallel behandling rørledning (MTPP) for gen-til-strukturen besluttet på at støtte konsortiet. Her beskriver vi de protokoller, der anvendes til at bestemme strukturen af ​​PB2 underenheden fra fire forskellige influenza A stammer.

De følgende resultater illustrerer de forventede resultater af den beskrevne protokol, og i tilfælde af PB2, de observerede resultater. Brug Gene Composer fem fuld længde mål aminosyresekvenser af influenzavirus polymerase subunit PB2 blev udformet (figur 2). De PB2 sekvenser blev tilbage oversat og udsat for mange tekniske trin 3, hvilket resulterer i codon harmoniserede sekvenser optimeret til ekspression i E. coli. From the IPCR produkter (figur 3b), i alt fire og tredive konstruktioner blev succesfuldt klonet ind i en modificeret pET28 vektor-system 10 med et N-terminalt 6x His-SMT fusion tag ved hjælp PIPE kloning 3 som vist i figur 3a. Et sammendrag af kloning arbejdsprocessen er præsenteret i figur 4.. Efter vellykket kloning, blev mikro-skala protein ekspression af hver konstruktion testet i BL21 (DE3) E.coli-celler. Celler blev dyrket i TB-medium suppleret med Novagen Natekspressen 1 medium (ifølge producentens protokol) i 48 timer ved 20 ° C i en rysteinkubator sæt ved 220 rpm. Efter vækst blev celler høstet og testet for opløseligt protein ekspression ved hjælp kapillære elektroforese med en Caliper LabChip 90. Fjorten af ​​de fireogtredive PB2 konstruktioner førte til opløseligt målprotein og trådte storskalafermentering. Stor-skala kulturer af hver konstruktion blev dyrket i TB-medium suppleret med Novagen s Natekspressen 1 medium ifølge producentens protokol. Efter vækst blev celler høstet via centrifugering og opbevaret ved -80 ° C. Proteinproduktion i stor skala ekspression af hver kultur blev bekræftet via SDS-PAGE-analyse (figur 5), før der fortsættes med stor skala oprensning. Protein Maker blev anvendt til at udføre parallelle oprensning af de fjorten PB2 konstruktioner. Den klarede lysater af all fjorten konstruktioner blev kørt gennem en nikkel-chelat-søjle. Efter bestemmelse hvilke fraktioner indeholdt målproteinet ved SDS-PAGE, blev de tilsvarende fraktioner puljet for hver prøve, og koncentrationen af hver blev bestemt ved en A280 læsning. Fjernelse af 6x His-SMT-tag blev udført ved tilsætning af ULP1 efterfulgt af dialyse natten og en anden nikkel kolonne. Bekræftelse af His-SMT tag fjernelse blev udført ved SDS-PAGE (figur 6), og hver prøve blev koncentreret med en 10 kDa Amicon Ultra centrifugerør. Efter koncentrering ved hjælp af Amicon Ultra centrifugerør blev hver prøve kørt over en dimensionering kolonne at opnå krystallografisk renhed. En anden koncentration blev udført for at øge proteinkoncentrationen til et niveau nødvendig til krystallisation. Alle fjorten konstruktioner lykkedes renset og trådte i krystallisering forsøg. Krystallisation blev initieret ved at optø tidligere frozen protein. Krystallisation blev udført i et klima kontrolleret rum ved 16 ° C med specielt designede plader (Emerald Bio) til at sidde drop dampdiffusion (figur 7). Indledende screening blev udført med fire sparsomme matrix-skærme, JCSG +, pagten, Wizard Fuld, og CryoFull (Emerald Bio), efter en længere Newman-strategi. 0,4 pi af protein Opløsningen blev derefter blandet med 0,4 pi crystallant (eller reservoir opløsning) fra det tilsvarende reservoir med 96-brønds Compact Jr krystallisering plader (Emerald Bio). Af de fjorten oprensede prøver ni af dem gav krystaller egnede til diffraktion undersøgelser (figur 8). Et in-house diffraktion datasæt blev indsamlet på fem af de ni konstruktioner krystalliserede ved Cu Ka frekvensbånd med en Rigaku SuperBright FR-E + roterende-anode X-ray generator forsynet med Osmic Varimax HF optik og en Saturn 944 + CCD-detektor (figur 9 ). Hvert datasæt blev behandlet med XDS / XScale 4 &lt;<html> / Sup&gt; og skaleres til en endelig løsning. Forsøg på at løse de strukturer ved molekylær erstatning blev udført med Phaser 5 fra CCP4 suite 7.. De endelige modeller blev opnået efter raffinement i REFMAC 7 og manuel ombygning med Coot 11.. Strukturerne blev vurderet og korrigeret for geometri og fitness med MolProbity 9.. I alt fire strukturer PB2 underenheden blev bestemt (figur 10), og deponeret i det foreløbige budgetforslag. Figur 11 illustrerer det samlede resultat på hvert trin i MTPP pipeline. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> Figur 1. Oversigt over SSGCID gen-til-strukturen vej for Multi-target parallel behandling på Emerald Bio. indhold &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; altid &quot;&gt; <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> Figur 2. Justering Viewer og Protein Construct Design Modul i Gene Composer software. Amino-syre base, konstruere af target er vist med grønt (midterste vindue) og strukturen guidede trunkeringer af alternative konstruktioner er vist i guld (nederste vindue). En tilpasning af flere Flu virale PB2 sekvenser er vist i forhold til sekvensen og sekundær strukturelementer af det C-terminale domæne fra PDBID 3CW4. Kendskab til det domæne struktur og sekundære strukturelementer tillader N-terminale trunkeringer at blive valgt i Gene Composer Design Module ved at højreklikke på det ønskede aminosyrerest. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . Figur 3a. PIPE kloning er illustreret, hvor det syntetiske gen indsatsen (orange) forstærkes af designet frem (rød-orange linjer) og reverse (orange-blå linjer) primere til at generere indsætte PCR materiale. Ekspressionsvektoren forstærkes med reverse (rød-sorte streger ) og frem (blå-sorte linjer) primere til at generere vektor PCR materiale. Terminalen sekvenser IPCR produkter er komplementære til de terminale sekvenser af vPCR produkter (red af IPCR supplerer rødt for vPCR og blå IPCR supplerer blå vPCR). Tillader dette IPCR og vPCR produkter at anneale at danne plasmider, der replikeres ved transformation til værten BL21 (DE3) kemisk kompetente E. coli-celler. <img alt="Figur 3b" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> Figur 3b. Agarosegelanalyse af IPCR produk<html> ts fra PB2 underenhed. IPCR fejl kan ses som svage eller smeary bands, mens succesfulde IPCR produkter er repræsenteret ved robuste bands. IPCR produktkvalitet kan generelt korreleret med kloning succes. Molekylvægtmarkører er i kilodalton. Figur er gengivet fra Raymond et al. 2011 12.. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> Figur 4.. Genteknologiske trin mål PB2 proteiner blev udført ved anvendelse af Gene Composer software. Efter manipuleret nucleinsyresekvens blev fastlagt for hvert mål blev 6-7 alternative proteinkilder konstruktioner designet til hver. Multi-target parallel behandling i de indledende trin af gen-design og kloning resulterede i 34 konstruktioner, hvoraf 14 var levedygtige mål, der producerede opløselige proteiner i E. coli. <html> re 5 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; Figur 5. Repræsentative SDS-PAGE analyse af omfattende fermentering viser robust proteinekspression (forventet størrelse på 25,76 kDa), omkring 50% opløseligt (bane 4) og omkring 50% spaltning af 6x His-SMT tag fra eluerede protein (bane 7). <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> Figur 6.. SDS-PAGE resultater for tre konstruktioner af polymerasen PB2 underenheden Lane 1, molekylvægt-markører (mærket til venstre i kDa),. Bane 2, 6 og 10, samlet protein fra Nikkel 1 kolonne, bane 3, 7 og 11, gennemstrømning af spaltet protein i buffer A fra Nickel 2, banerne 4, 8 og 12, fjernelse af 6x His-Smt tag i buffer B fra Nickel 2. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; Figur 7. En skematisk af dampdiffusion ved siddende slip-metoden. Mødet drop metode til proteinkrystallisation falder ind under kategorien af dampe diffusion. Denne metode indebærer en oprenset prøve af protein og fældningsmiddel i ligevægt med et større reservoir med samme forhold i en højere koncentration. Da vand fordamper fra proteinet prøven og overførsler til reservoiret, den fældningsmiddel koncentrationen stiger til et optimalt niveau for protein krystallisering. <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> Figur 8. Protein krystal af polymerase PB2 underenhed fra en stamme af influenzavirus. <img alt="Figur 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> Figur 9. Røntgendiffraktion billede af polymerasen PB2 underenheden fra enstamme af influenzavirus. <img alt="Figur 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> Figur 10.. Ribbon diagrammer af molekylerne i den krystallografiske asymmetriske enhed af 4 PB2 strukturer. Sekundære strukturer farvet i regnbue mønster med tilsvarende PDB koder. (A) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / Mexico / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="Figur 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> Figur 11. Outcome analyse for influenza PB2 mål ved de beskrevne metoder. Den struktue beslutsomhed pipeline er illustreret i fem trin: Kloning, opløselighed, rensning, krystallisering og struktur beslutsomhed.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Struktur-baserede drug design spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​lægemidler. Fortsat flere mål parallelt øger chancen for succes for bly opdagelse. Følgende artikel belyser, hvordan Seattle Strukturel Genomics Center for smitsomme sygdomme benytter en multi-target metode til gen-til-struktur bestemmelse af PB2 influenza A underenhed.

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-til-struktur Bestemmelse af Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrensning af Influenzavirus ribonukleoprotein komplekser fra kromatin af inficerede celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration af rekombinant influenzavacciner i kimære musemodeller at studere slimhindeimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoudfældning af musen Mx1 Protein med influenza A-virus nukleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes for influenza A-virus Detection og Isolering fra svin

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

En miniature Glycan Microarray Assay til Vurdering Aviditet og specificitet influenza A-virus hæmagglutininer

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In vitro Demontering af influenza A-virus capsider ved gradientcentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescensbaseret neuraminidase-inhiberingsassay i vurdering af den følsomhed over influenzavira til neuraminidaseinhibitoren Class of Antivirale

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...