Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

De auteurs willen graag alle leden van het consortium SSGCID bedanken. Doelrealisatie de SSGCID&#39;s wordt mogelijk gemaakt door de enorme inspanningen van alle teamleden bij Emerald Bio. Dit onderzoek werd gefinancierd onder Federal Contract No HHSN272200700057C van het Nationale Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten, de National Institutes of Health en het ministerie van Volksgezondheid en Human Services.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

De auteurs zijn medewerkers van Emerald Bio, Inc

Multi-Target Parallel Processing Structure-based drug design speelt een belangrijke rol in drug discovery. De SSGCID is gewijd aan het verstrekken van de wetenschappelijke gemeenschap met de drie-dimensionale eiwitstructuren van NIAID categorie AC ziekteverwekkers. Maken van dergelijke structurele informatie op grote schaal beschikbaar zal uiteindelijk dienen om structuur-based drug design versnellen. De eerste kritieke stap van de MTPP aanpak is construct ontwerp. Meerdere constructies van elk doelwit eiwit verhoogt de kans op een succesvolle structuurbepaling en verhoogt de ommekeer. Het is onvermijdelijk dat sommige eiwitconstructen zal falen tijdens stadia van de pijpleiding. Uitvoering van de PIPE kloonmethode ondersteunt MTPP methode doordat het genereren van vele constructies in 96-well formaat zonder arbeidsintensief zuiveringsstappen. Koppelen PIPE klonen met de mogelijkheid om proteïne-expressie te analyseren in dezelfde 96 putjes (Caliper LabChip 90) versnelt verder de totale stroom. De koppeling van deze werkwijzen maakt een snelle identificatie van constructen die oplosbaar eiwit dat het succes van grootschalige productie en zuivering eiwit zorgt produceren. Essentieel voor het succes van de MTPP high-throughput is de Protein Maker (Amerikaans octrooischrift 6.818.060, Emerald Bio) instrument. De Protein Maker is een 24-kanaals parallel vloeistof-chromatografie-systeem speciaal ontwikkeld om de efficiëntie van high-throughput eiwit productie en aanverwante structurele genoom pijplijn onderzoek toepassingen te stimuleren. Met behulp van de eerder beschreven protocol voor de Protein Maker, de voordelen duidelijk ten opzichte van een lijn FPLC systeem. Een enkele persoon kan zuiveren tot 48 doelen in parallel binnen een periode van acht uur. In tegenstelling, kan een persoon met behulp van een enkele lijn FPLC systeem slechts maximaal vier doelen binnen dezelfde termijn te zuiveren. De hoge niveaus van zuiverheid voor elk doelbereikt met de Protein Maker is een kritische factor in de latere succes van groeiende eiwitkristallen voor structuuranalyse. Beperkingen en problemen oplossen Problemen driedimensionale structuren door x-ray kristallografie is een getrapte inspanning met vele uitdagingen, waarvan het onvermogen om grote hoeveelheden oplosbaar doelwiteiwit verkrijgen. Een strategie die kan worden toegepast om de oplosbaarheid probleem te overwinnen is het gebruik van een andere expressie gastheer zoals E. coli-cellen niet in staat een aantal belangrijke eukaryote post-translationele modificaties uitvoeren. Expressie in diverse gist, insect en zoogdier cellijnen die in staat zijn het uitvoeren van deze post-translationele modificaties zijn vaak een geschikt alternatief. Doeleiwitten worden soms uitgedrukt maar volledig onoplosbaar in de standaard lysis voorwaarden. De Protein Maker kan een waardevolle bron voor het snelle testen van alternatieve cellysis omstandighedenzoals beschreven in Smith et al.. 2011 13. Deze strategie is vaak noodzakelijk om doelstellingen bewegen door de leiding. In geen structurele genomics pijpleidingen, dan kunnen gestandaardiseerde protocollen niet geschikt voor iedere doelgroep die door de pijpleiding en de doelstellingen kunnen individuele optimalisatie nodig komt. Zo is gekozen voor 20% ethyleenglycol gebruikt voor elke cryobeschermingsmiddel. In de gevallen dat deze voorwaarde niet geschikt is, kunnen alternatieve cryoprotectants of concentraties moeten worden getest. Vanwege het unieke karakter van elk eiwit doel, de snelheidsbeperkende stap in en onvoorspelbare bepalen van een structuur kristallisatie. De MTPP pijplijn compenseert de algemeen lage slagingspercentage van eiwitkristallisatie met optimalisering van de eerste spaarzame matrix schermen. Elke eerste kristallen raakte uit commercieel beschikbare sparse matrix schermen wordt verder geoptimaliseerd met een E-Screen Builder (Emerald Bio). De optimalisatie-scherm is ontworpen areluid de toestand van het oorspronkelijke kristal hit, het veranderen van de concentraties van de buffers, zouten en additieven. Succesvolle optimalisatie schermen opleveren kristallen geschikt voor diffractie studies en structuurbepaling. De structurele genomics-programma naar voren gebracht door het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIAID) financiert Emerald Bio en drie andere Pacific Northwest instellingen die samen de SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, de Universiteit van Washington en de Pacific Northwest National Laboratory) . Elk lid van het consortium is gekozen om hun expertise in het toepassen van state-of-the-art technologieën die nodig zijn voor het bereiken van de doelstellingen van het NIAID structurele genomics-programma. Tot op heden heeft SSGCID 461 structuren gestort in het VOB ranking als de zevende grootste bijdrage in de wereld, en in 2011, de meest productieve. De protocollen en methodologieën van de SSGCID zijn voorzien van de bedoeling van het voordeel van dewetenschappelijke gemeenschap en het bestendigen van het onderzoek van infectieziekten.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

Pandemieën van zeer virulente stammen influenza kunnen overal morbiditeit en mortaliteit in menselijke populaties wereld veroorzaakt. In de Verenigde Staten alleen al gemiddeld 41.400 doden en 1.860.000 ziekenhuisopnames veroorzaakt door influenza virus infectie elk jaar 1. Puntmutaties in het polymerase basisch eiwit subunit 2 (PB2) zijn gekoppeld aan de aanpassing van de virale infectie in mensen 2. Resultaten van die studies hebben de biologische betekenis van PB2 geopenbaard als een virulentie factor, waardoor het potentieel benadrukken als een antivirale drug target. De structurele genomics-programma naar voren gebracht door het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIAID) financiert Emerald Bio en drie andere Pacific Northwest instellingen die samen de Seattle Structural Genomics Centrum voor Infectieziektebestrijding (SSGCID). De SSGCID is gewijd aan het verstrekken van de wetenschappelijke gemeenschap met drielandene-dimensionale eiwitstructuren van NIAID categorie AC pathogenen. Maken van dergelijke structurele informatie beschikbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap dient te structure-based drug design versnellen. Structure-based drug design speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Nastreven van meerdere doelen tegelijkertijd verhoogt de kans op succes voor de nieuwe lead discovery door gericht op een pad of een hele eiwit familie. Emerald Bio heeft een high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) voor gen-tot-structuur vastberadenheid om het consortium te ondersteunen ontwikkelde. Hier beschrijven we de protocollen die worden gebruikt om de structuur van de PB2 subeenheid bepalen vanuit vier verschillende influenza A-stammen.

De volgende resultaten illustreren de verwachte resultaten van de beschreven protocol, en bij PB2, de waargenomen resultaten. Gebruik Gene Composer, vijf full-length doelwit aminozuursequenties van het influenzavirus PB2 polymerase subunit werden ontworpen (Figuur 2). De PB2 sequenties werden terugvertaald en onderworpen aan vele technische stappen 3, resulterend in codon geharmoniseerde sequenties geoptimaliseerd voor expressie in E. coli. Uit de iPCR producten (figuur 3b), een totaal van vierendertig constructen werden succesvol gekloneerd in een gemodificeerde vector pET28 systeem 10 met een N-terminaal 6x His-tag fusie Smt middels PIPE klonering 3 zoals getoond in figuur 3a. Een samenvatting van de klonen workflow wordt weergegeven in figuur 4. Na succesvolle klonen, werd micro-schaal eiwit expressie van elk construct in BL21 (DE3) E. getestcoli cellen. Cellen werden gekweekt in TB-medium aangevuld met Novagen Overnight Express 1 medium (volgens het protocol van de fabrikant) gedurende 48 uur bij 20 ° C in een schuddend incubator ingesteld op 220 rpm. Na groei werden de cellen geoogst en getest op oplosbare proteïne expressie met behulp van capillaire elektroforese met een schuifmaat LabChip 90. Veertien van de vierendertig PB2 constructen tot oplosbaar doelwiteiwit en opgenomen grootschalige fermentatie. Grootschalige kweken van elk construct werden gekweekt in TB-medium aangevuld met Novagen de Overnight Express 1 Medium volgens protocol van de fabrikant. Na groei werden de cellen geoogst door centrifugatie en opgeslagen bij -80 ° C. Grootschalige eiwitexpressie van elke kweek werd bevestigd via SDS-PAGE-analyse (figuur 5) alvorens grootschalige zuivering. De Protein Maker werd gebruikt om parallelle zuivering van de veertien PB2 constructen voeren. Het geklaarde lysaten van all veertien constructies werden uitgevoerd door middel van een nikkel-chelaat kolom. Na het bepalen welke fracties doeleiwit door SDS-PAGE bevatten, werden de overeenkomstige fracties samengevoegd voor elk monster en de concentratie van elk werd bepaald door een A280 lezing. Verwijdering van de 6x His-tag Smt werd uitgevoerd door toevoeging van ULP1 gevolgd door dialyse gedurende de nacht en een tweede kolom nikkel. Bevestiging van de His-tag Smt verwijdering werd uitgevoerd door SDS-PAGE (figuur 6), en elk monster werd geconcentreerd met een 10 kDa Amicon Ultra centrifugebuis. Na concentratie met behulp van de Amicon Ultra centrifuge buizen, werd elk monster overreden een sizing kolom kristallografische zuiverheid te bereiken. Een tweede concentratie werd uitgevoerd om de eiwitconcentratie te verhogen tot een niveau dat nodig is voor kristallisatie. Alle veertien constructen werden met succes gezuiverd en kwamen in kristallisatie onderzoeken. Kristallisatie werd geïnitieerd door het ontdooien van de eerder frOzen eiwit. Kristallisatie werd uitgevoerd in een geconditioneerde ruimte bij 16 ° C met aangepaste platen (Emerald Bio) te zitten druppeldampdiffusie diffusie (figuur 7). Eerste screening werd uitgevoerd met vier sparse-matrix schermen; JCSG +, Pact, Wizard Volledig en CryoFull (Emerald Bio), na een langdurige Newman strategie. 0.4 ul eiwitoplossing werd vervolgens gemengd met 0,4 gl crystallant (of reservoiroplossing) van de overeenkomstige reservoir met 96 putjes Compact Jr kristallisatie platen (Emerald Bio). Van de veertien gezuiverde monsters negen van hen gaf kristallen geschikt voor diffractie studies (figuur 8). Een in-house diffractie data set werd verzameld op vijf van de negen constructen gekristalliseerd bij Cu Ka-frequentieband met een Rigaku SuperBright FR-E + roterende-anode X-ray generator uitgerust met Osmic varimax HF-lens en een Saturn 944 + CCD-detector (figuur 9 ). Elke dataset is verwerkt met XDS / XSCALE 4 &lt;<html> / Sup&gt; en geschaald tot een definitieve oplossing. Pogingen om de structuren te lossen door moleculaire vervanging werden met Phaser 5 uitgevoerd vanaf de CCP4 suite 7. De laatste modellen werden verkregen na verfijning in REFMAC 7 en handmatige herbouw met Meerkoet 11. De structuren werden beoordeeld en gecorrigeerd voor geometrie en fitness met MolProbity 9. Een totaal van vier structuren van het PB2 subunit werden bepaald (figuur 10) en gestort in het VOB. Figuur 11 illustreert het algemene resultaat in elk stadium van de MTPP pijplijn. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> Figuur 1. Overzicht van de SSGCID target-tot-structuur route voor Multi-target parallelle verwerking bij Emerald Bio. Inhoud &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; altijd &quot;&gt; <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> Figuur 2. Uitlijning Viewer en Protein Construct Ontwerp Module in Gene Composer software. Aminozuur basis constructie van doel worden in groen (middelste venster) en de structuur geleide inkortingen van alternatieve constructen zijn weergegeven in goud (onderste venster). Een uitlijning van meerdere sequenties Flu virale PB2 wordt vergeleken met de sequentie en secundaire structuurelementen het C-terminale domein van PDBID 3CW4. Kennis van het domein structuur en de secundaire structuur elementen maakt N-terminale inkortingen te kiezen binnen de Gene Composer Ontwerp Module door met de rechtermuisknop te klikken op de gewenste aminozuur residu. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . Figuur 3a. PIPE klonen wordt geïllustreerd waarbij het ​​synthetisch gen insert (oranje) wordt versterkt door voorwaarts gemaakt (rood-oranje lijnen) en achteruit (oranje-blauwe lijnen) primers voor het genereren voegen PCR materiaal. De expressie vector wordt versterkt met omgekeerde (rood-zwarte lijnen ) en forward (blauw-zwarte lijnen) primers voor PCR vector materiaal te genereren. De terminale sequenties iPCR producten zijn complementair aan de terminale sequenties van vPCR producten (rood van iPCR aanvulling rood van vPCR en blauw van iPCR aanvulling blauw van vPCR). Dit maakt het iPCR en vPCR producten te gloeien om plasmiden die worden gerepliceerd na transformatie in gastheercellen BL21 (DE3) chemisch competente E. vormen coli cellen. <img alt="Figuur 3b" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> Figuur 3b. Agarose gel analyse van iPCR productie<html> ts van de PB2 subeenheid. iPCR storingen kan worden beschouwd als zwakke of smeary banden, terwijl succesvolle iPCR producten worden weergegeven door robuuste bands. iPCR productkwaliteit kan in het algemeen gecorreleerd met succes klonen. Molecuulgewichtsmerkers zijn kiloDalton. Figuur is overgenomen uit Raymond et al.., 2011 12. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> Figuur 4. Gentechniek stappen doelwit eiwitten PB2 werden uitgevoerd met Gene Composer. Nadat de kunstmatige nucleïnezuur-sequentie werd vastgesteld voor elk doel, werden 6-7 alternatieve eiwit constructen voor elke. Multi-target parallelle verwerking in de eerste stappen van gen ontwerpen en klonering resulteerde in 34 constructen, waarvan 14 levensvatbaar waren doelen die oplosbare eiwitten in E. geproduceerd coli. <html> re 5 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; Figuur 5. Representatieve SDS-PAGE analyse van grootschalige fermentatie geeft sterke eiwitexpressie (verwachte grootte van 25,76 kDa), ongeveer 50% oplosbaar (baan 4) en ongeveer 50% splitsing van 6x His-tag van Smt geëlueerde eiwit (laan 7). <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> Figuur 6. SDS-PAGE resultaten voor drie constructen van de polymerase PB2 subeenheid Lane 1, molecuulgewicht merkers (aangeduid links in kDa). Lanen 2, 6 en 10, samengevoegd eiwit uit nikkel kolom 1, lanen 3, 7 en 11, doorstroom van gesplitste eiwit in buffer A van Nickel 2, lanen 4, 8 en 12, het verwijderen van 6x His-tag Smt in buffer B van Nickel 2. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; Figuur 7. Een schema van dampdiffusie door de zittende neerzetten. De zittende neerzetten voor eiwitkristallisatie valt onder de categorie van de dampdiffusie. Deze methode is een gezuiverd monster van eiwit en neerslagmiddelen equilibreren met een groter reservoir dat vergelijkbare omstandigheden een hogere concentratie. Zoals water verdampt uit het eiwit monster en transfers naar het reservoir, de precipitant concentratie toeneemt tot een optimaal niveau voor eiwitkristallisatie. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> Figuur 8. Eiwitkristal polymerase PB2 subeenheid van een stam van het influenzavirus. <img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> Figuur 9. Röntgendiffractie beeld van de polymerase PB2 subeenheid van eenstam van het influenzavirus. <img alt="Figuur 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> Figuur 10. Lint&#39;s van de moleculen in de asymmetrische eenheid van kristallografische 4 PB2 structuren. Secundaire structuren gekleurd in regenboog patroon met overeenkomstige VOB codes. (A) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / Mexico / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="Figuur 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> Figuur 11. Uitkomstanalyse voor influenza PB2 doelstellingen die door de beschreven methoden. De structure bepaling pijplijn wordt geïllustreerd in vijf stappen: Klonen, oplosbaarheid, zuivering, kristallisatie en structuurbepaling.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Structure-based drug design speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Nastreven van meerdere doelen tegelijkertijd verhoogt de kans op succes voor lood ontdekking. Het volgende artikel belicht hoe de Seattle Structural Genomics Centrum Infectieziektebestrijding maakt gebruik van een multi-target benadering voor gen-tot-structuur bepaling van de PB2 influenza A subunit.

Multi-target Parallel Processing Aanpak voor Gene-to-structuur bepalen van de Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Met behulp van Bioluminescent Imaging naar Synergie Onderzoek Between Streptococcus pneumoniae En influenza A-virus bij jonge muizen

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Kwantitatieve analyses van alle Influenza A Virale Hemagglutinins en neuraminidases gebruik van Universal Antistoffen Type in de eenvoudige Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitatie van de Muis Mx1 eiwit met het influenza A-virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasale Doekjes voor het influenza A-virus detectie en isolatie van Varkens

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Geminiaturiseerde Glycan Microarray Assay voor het beoordelen van Avidity en specificiteit van influenza A-virus hemagglutinine

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Demontage van influenza A-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescentie gebaseerde neuraminidase remmingstest om de gevoeligheid van de influenza virussen zijn voorgesteld om de neuraminidase remmer Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...