Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du consortium SSGCID. Réalisation des objectifs de la SSGCID est rendue possible par les efforts considérables déployés par tous les membres de l&#39;équipe à Emerald Bio. Cette recherche a été financée au titre du contrat fédéral n ° HHSN272200700057C de l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses, les Instituts de la Santé et le ministère de la Santé et des Services sociaux nationale.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

Les auteurs sont des employés de Emerald Bio, Inc.

Multi-Target Parallel Processing Structure basée sur la conception de médicaments joue un rôle important dans la découverte de médicaments. Le SSGCID se consacre à fournir à la communauté scientifique des structures protéiques de trois dimensions à partir de NIAID catégorie pathogènes AC. Rendre cette information structurelle largement disponibles finira par servir à accélérer la structure basée sur la conception de médicaments. La première étape critique de l&#39;approche MTPP est de conception construction. Constructions multiples de chaque protéine cible augmente la probabilité de succès de détermination de la structure et des augmentations redressement. Il est inévitable que certaines constructions de protéines vont échouer au cours des étapes du pipeline. La mise en œuvre de la méthode de clonage PIPE en charge la méthode MTPP en permettant la génération de nombreuses constructions en format 96 puits sans travail des étapes de purification intensive. Jumelage clonage PIPE avec la capacité d&#39;analyser l&#39;expression des protéines dans le même format de 96 puits (Étrier LabChip 90) accélère encore le flux global. Le jumelage de ces méthodes permet d&#39;identifier rapidement des constructions qui produisent des protéines solubles qui assure le succès de la production de protéines à grande échelle et de purification. Un aspect essentiel à la réussite de la MTPP haut débit est le Créateur de protéines (brevet américain n ° 6,818,060, Emerald Bio) instrument. La protéine Maker est un système de chromatographie liquide parallèle à 24 canaux spécialement conçu pour accroître l&#39;efficacité de la production de protéines à haut débit et des applications de recherche de pipelines génomique structurale connexes. Selon le protocole décrit précédemment pour la protéine Maker, les avantages sont évidents par rapport à un système de FPLC sur une seule ligne. Une seule personne peut purifier jusqu&#39;à 48 cibles en parallèle dans un délai de huit heures. En revanche, une seule personne utilisant un système FPLC sur une seule ligne ne peut purifier un maximum de quatre cibles dans le même délai. Les hauts niveaux de pureté pour chaque cibleréalisé avec la protéine Maker est un facteur critique dans la réussite future de la cristallisation des protéines pour l&#39;analyse de la structure. Limitations et dépannage Résoudre des structures tridimensionnelles par cristallographie aux rayons X est un effort multi-étagée avec de nombreux défis, dont l&#39;un est l&#39;incapacité d&#39;obtenir de grandes quantités de protéine cible soluble. Une stratégie qui peut être mis en œuvre pour résoudre le problème de solubilité est l&#39;utilisation d&#39;un hôte d&#39;expression alternatif comme E. cellules de E. coli sont incapables de réaliser plusieurs importantes modifications post-traductionnelles eucaryotes. Expression dans diverses levures, lignées de cellules d&#39;insectes et de mammifères qui sont capables d&#39;effectuer ces modifications post-traductionnelles sont souvent une alternative appropriée. protéines cibles sont parfois exprimées, mais totalement insoluble dans les conditions de lyse standard. La protéine Maker peut être une ressource précieuse pour le dépistage rapide des conditions de lyse cellulaire alternativescomme décrit dans Smith et al. 2011 13. Cette stratégie est souvent nécessaire de maintenir des cibles se déplaçant à travers le pipeline. En tout pipeline génomique structurale, protocoles standardisés peuvent ne pas convenir à toutes les cibles qui vient à travers le pipeline et les objectifs peuvent nécessiter une optimisation individuelle. Par exemple, nous avons choisi d&#39;utiliser 20% d&#39;éthylène glycol pour chaque cryoprotecteur. Dans les cas que cette condition n&#39;est pas approprié, cryoprotectants ou les concentrations d&#39;autres peuvent avoir besoin d&#39;être testé. En raison de la nature unique de chaque protéine cible individuelle, limitant la vitesse et imprévisible étape dans la détermination de la structure est la cristallisation. Les décalages de pipelines MTPP le taux de réussite généralement faible de cristallisation des protéines avec l&#39;optimisation des écrans à matrice clairsemée initiales. Chaque cristal initial frapper des écrans de matrices creuses disponibles dans le commerce est optimisée avec un constructeur E-Screen (Emerald Bio). L&#39;écran d&#39;optimisation est conçu arolide l&#39;état du tube en cristal initiale, modifiant les concentrations des tampons, des sels, et les additifs. Écrans optimisation réussie donner des cristaux appropriés pour les études de diffraction et de la détermination de la structure. Le programme de génomique structurale mis de l&#39;avant par l&#39;Institut national des allergies et maladies infectieuses (NIAID) fournit du financement à Emerald Bio et trois autres institutions du Nord-Ouest du Pacifique qui sont ensemble le SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, l&#39;Université de Washington et Pacific Northwest National Laboratory) . Chaque membre du consortium a été choisi pour son expertise dans l&#39;application des technologies state-of-the-art nécessaires à la réalisation des objectifs du programme de génomique structurale NIAID. À ce jour, SSGCID a déposé 461 structures dans le classement APB comme le septième plus grand contributeur dans le monde, et en 2011, la plus productive. Les protocoles et méthodologies du SSGCID sont fournis avec l&#39;intention de bénéficier de lacommunauté scientifique et la perpétuation de la recherche sur les maladies infectieuses.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

Pandémies de souches de virus influenza hautement virulentes peuvent provoquer la morbidité et de la mortalité répandue dans les populations humaines à travers le monde. Aux États-Unis seulement, une moyenne de 41.400 morts et 1,86 million d&#39;hospitalisations sont causées par une infection de virus de la grippe chaque année 1. Des mutations ponctuelles dans la polymérase de base protein 2 sous-unité (PB2) ont été liés à l&#39;adaptation de l&#39;infection virale chez l&#39;homme 2. Les résultats de ces études ont mis en évidence l&#39;importance biologique de PB2 comme un facteur de virulence, mettant ainsi en évidence son potentiel en tant que cible thérapeutique antivirale. Le programme de génomique structurale mis de l&#39;avant par l&#39;Institut national des allergies et maladies infectieuses (NIAID) fournit du financement à Emerald Bio et trois autres institutions du Nord-Ouest du Pacifique qui, ensemble, forment le Centre de génomique structurelle Seattle pour les maladies infectieuses (SSGCID). Le SSGCID se consacre à fournir à la communauté scientifique threstructures protéiques e-dimensionnelles de NIAID catégorie pathogènes AC. Rendre cette information structurelle à la disposition de la communauté scientifique sert à accélérer la structure basée sur la conception de médicaments. Structure basée sur la conception de médicaments joue un rôle important dans le développement de médicaments. La poursuite des cibles multiples en parallèle augmente considérablement les chances de succès pour la nouvelle découverte de plomb en ciblant une voie ou une famille de protéine entière. Emerald Bio a développé un pipeline de traitement parallèle haut débit, multi-cible (MTPP) pour la détermination gène à la structure pour soutenir le consortium. Nous décrivons ici les protocoles utilisés pour déterminer la structure de la sous-unité PB2 de quatre grippe A souches différentes.

Les résultats suivants illustrent les résultats attendus du protocole décrit, et dans le cas de PB2, les résultats observés. Utiliser Gene Compositeur, cinq séquences d&#39;acides aminés cibles pleine longueur de la sous-unité PB2 polymérase du virus de l&#39;influenza ont été conçus (Figure 2). Les séquences PB2 ont été traduits en arrière et soumis à de nombreuses étapes d&#39;ingénierie 3, entraînant des codons séquences harmonisées optimisés pour l&#39;expression dans E. coli. des produits IPCR (Figure 3b), un total de trente-quatre constructions ont été clonés avec succès dans un système de vecteur pET28 10 modifié avec un N-terminal 6x His-Smt tag de fusion en utilisant PIPE clonage 3 comme indiqué sur la Figure 3a. Un résumé des flux de clonage est présenté dans la Figure 4. Après le succès du clonage, l&#39;expression des protéines micro-échelle de chaque construction a été testé dans BL21 (DE3) E.cellules de E. coli. Les cellules ont été cultivées dans un milieu de TB complétée par Novagen Nuit 1 moyen Express (selon le protocole du fabricant) de 48 h à 20 ° C dans un incubateur réglé agitation à 220 rpm. Après la croissance, les cellules ont été récoltées et testées pour l&#39;expression de la protéine soluble utilisant électrophorèse capillaire avec un étrier LabChip 90. Quatorze des trente-quatre PB2 constructions ont conduit à la protéine cible soluble et est entré fermentation à grande échelle. Cultures à grande échelle de chaque construction ont été cultivées dans un milieu de TB complété avec Nuit 1 moyen Express Novagen selon le protocole du fabricant. Après la croissance, les cellules ont été récoltées par centrifugation et stockés à -80 ° C. Expression de protéines à grande échelle de chaque culture a été confirmée par une analyse SDS-PAGE (figure 5) avant de procéder à la purification à grande échelle. La protéine Maker a été utilisé pour effectuer la purification parallèle des quatorze constructions PB2. Les lysats clarifiés d&#39;all quatorze constructions ont été réalisées à travers une colonne nickel-chélate. Après avoir déterminé les fractions contenant la protéine cible par SDS-PAGE, les fractions correspondantes ont été regroupées pour chaque échantillon et la concentration de chacun a été déterminé par une lecture A280. Retrait de l&#39;étiquette His-Smt 6x a été menée par l&#39;ajout de Ulp1 suivie d&#39;une dialyse pendant la nuit et une deuxième colonne de nickel. Confirmation de la suppression de l&#39;étiquette His-Smt a été menée par SDS-PAGE (figure 6), et chaque échantillon a été concentré avec une kDa tube à centrifuger Amicon Ultra 10. Après concentration à l&#39;aide des tubes à centrifuger Amicon Ultra, chaque échantillon a été effectuée sur une colonne dimensionnement pour atteindre la pureté cristallographique. Une seconde concentration a été réalisée pour augmenter la concentration en protéine à un niveau nécessaire pour la cristallisation. Les quatorze constructions ont été purifiés avec succès et inclus dans des essais de cristallisation. La cristallisation a été initié par le dégel précédemment frprotéines ozen. La cristallisation a été effectuée dans une pièce climatisée à 16 ° C avec des plaques spécialement conçues (Emerald Bio) pour s&#39;asseoir baisse de la diffusion de vapeur (Figure 7). Sélection initiale a été menée avec quatre écrans à matrice clairsemée; JCSG +, pacte, magicien plein, et CryoFull (Emerald Bio), suivant une stratégie Newman prolongée. 0,4 pi de solution de protéines a ensuite été mélangé avec 0,4 l de crystallant (ou solution de réservoir) du réservoir correspondant en utilisant des plaques de cristallisation Jr 96 puits compacts (Emerald Bio). Sur les quatorze échantillons purifiés neuf d&#39;entre eux a donné des cristaux appropriés pour les études de diffraction (figure 8). Un ensemble de données diffraction en interne ont été recueillies sur cinq des neuf constructions cristallisées au Cu Ka longueur d&#39;onde en utilisant un générateur Rigaku SuperBright FR-E + anode tournante de rayons X équipé d&#39;optiques Osmic VariMAX HF et un 944 détecteur Saturn + CCD (Figure 9 ). Chaque jeu de données a été traitée avec XDS / XSCALE 4 &lt;<html> / Sup&gt; et redimensionnée à une résolution finale. Les tentatives pour résoudre les structures de remplacement moléculaire ont été réalisées avec Phaser 5 de la CCP4 Suite 7. Les modèles finaux ont été obtenus après raffinement dans REFMAC 7 et reconstruction manuelle avec Foulque 11. Les structures ont été évaluées et corrigées pour la géométrie et de remise en forme avec MolProbity 9. Un total de quatre structures de la sous-unité PB2 ont été déterminés (Figure 10) et déposé dans l&#39;APB. Figure 11 illustre le résultat global à chaque étape du pipeline MTPP. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble du gène à la structure SSGCID voie pour le traitement parallèle multi-cibles à Emerald Bio. contenu &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> Figure 2. Visualisation de l&#39;alignement et la protéine selon module de conception dans les logiciels de compositeur Gene. La base d&#39;acides aminés construire de cible est représenté en vert (fenêtre du milieu) et la structure troncatures guidées de constructions alternatives sont indiquées en or (fenêtre du bas). Un alignement de plusieurs PB2 séquences virales de la grippe est représentée par rapport à la séquence et les éléments de structure secondaire du domaine C-terminal de 3CW4 PDBID. La connaissance de la structure de domaine et des éléments de structure secondaire permet troncatures N-terminaux à être choisis au sein de l&#39;Composer Conception Module de Gene par un clic droit sur ​​le résidu d&#39;acide aminé souhaité. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . Figure 3a. PIPE clonage est illustré dans lequel l&#39;insert de gène synthétique (orange) est amplifié par conçus avant (lignes rouge-orange) et inverser amorces (lignes orange bleu) pour générer des instructions INSERT matériau PCR. Le vecteur d&#39;expression est amplifiée avec des lignes arrière (rouge-noir ) et à terme (lignes bleu-noir) pour générer des amorces PCR matériel vecteur. Les séquences des produits de IPCR terminaux sont complémentaires aux séquences terminales des produits RVPC (rouge de iPCR complète de RVPC rouge et bleu de iPCR compléments bleu de RVPC). Ceci permet aux produits de IPCR et RVPC pour recuire pour former des plasmides qui sont répliquées après transformation dans l&#39;hôte BL21 (DE3) E. chimiquement compétente cellules de E. coli. <img alt="Figure 3b" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> Figure 3b. Analyse sur gel d&#39;agarose de iPCR production<html> ts de la sous-unité PB2. échecs IPCR peuvent être considérées comme faibles bandes ou graisseux, tandis que les produits IPCR réussies sont représentés par des bandes robustes. la qualité du produit iPCR peut généralement être corrélée avec la réussite du clonage. Des marqueurs de poids moléculaires sont en kilodaltons. Figure est reproduit à partir de Raymond et al., 2011 12. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> Figure 4. Gene étapes d&#39;ingénierie de cible PB2 de protéines ont été effectuées en utilisant un logiciel de compositeur Gene. Après la séquence d&#39;acide nucléique d&#39;ingénierie a été établi pour chaque cible, les constructions alternatives de protéines 6-7 ont été conçus pour chacun. Traitement parallèle multi-cibles dans les étapes initiales de la conception des gènes et le clonage a donné lieu à 34 constructions, dont 14 étaient des cibles viables qui produisent des protéines solubles dans E. coli. <html> re 5 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; Figure 5. Représentant analyse SDS-PAGE de fermentation à grande échelle montrant l&#39;expression de la protéine robuste (taille attendue de 25,76 kDa), environ 50% soluble (piste 4) et environ 50% clivage de tag 6x His-Smt de protéine éluée (piste 7). <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> Figure 6. Résultats SDS-PAGE pour trois constructions de la polymérase sous-unité PB2 Lane 1, les marqueurs de poids moléculaire (étiqueté à gauche en kDa);. Pistes 2, 6 et 10, les protéines commun de Nickel colonne 1, lignes 3, 7 et 11, dynamique de la protéine clivée dans le tampon A partir Nickel 2, lignes 4, 8 et 12, le retrait de l&#39;étiquette 6x His-Smt dans le tampon B de Nickel 2. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; Figure 7. Un schéma de diffusion de la vapeur par la méthode de la goutte assise. L&#39;méthode de la goutte assise pour la cristallisation des protéines tombe dans la catégorie de la diffusion de vapeur. Cette méthode est basée sur un échantillon purifié de la protéine et précipitant à l&#39;équilibre avec un réservoir contenant de plus des conditions similaires dans une concentration plus élevée. Comme l&#39;eau se vaporise à partir de l&#39;échantillon des protéines et des transferts vers le réservoir, la concentration en agent précipitant augmente à un niveau optimal pour la cristallisation de la protéine. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> Figure 8. cristaux de protéine de sous-unité de polymérase PB2 à partir d&#39;une souche du virus de la grippe. <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> Figure 9. L&#39;image de diffraction aux rayons X de la polymérase PB2 sous-unité à partir d&#39;unla souche du virus de la grippe. <img alt="Figure 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> Figure 10. Diagrammes de ruban des molécules dans l&#39;unité asymétrique cristallographique de 4 PB2 structures. Des structures secondaires de couleur dans le motif arc en ciel avec des codes PDB correspondant. (A) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / Mexique / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="Figure 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> Figure 11. analyse des résultats pour la grippe PB2 cibles par les méthodes décrites. L&#39;structure pipeline de détermination est illustrée en cinq étapes: détermination clonage, la solubilité, la purification, la cristallisation et la structure.

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Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

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