Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לכל חברי הקונסורציום SSGCID. השגת היעדים של SSGCID מתאפשרת על ידי המאמצים הכבירים של כל חברי צוות באמרלד ביו. מחקר זה מומן בHHSN272200700057C מספר החוזים פדרלי מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, המכונים הלאומי לבריאות ומחלקת בריאות ושירותי אנוש.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

הכותבים הם עובדים של אמרלד ביו, Inc

עיבוד מקביל רב יעד תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בגילוי תרופות. SSGCID מחויבת לספק לקהילה המדעית עם מבנים חלבוניים תלת ממד מפתוגנים NIAID הקטגוריה AC. הפיכת מידע לזמין לציבור רחב כגון מבני תשמש סופו של דבר להאצת תכנון תרופות המבוסס על מבנה. הצעד הקריטי הראשון של גישת MTPP הוא עיצוב מבנה. בונה מרובות של כל חלבון המטרה מגדילה את ההסתברות של קביעת מבנה מוצלחת ותפנית עליות. זה בלתי נמנע שכמה מבני חלבונים ייכשלו במהלך שלבים שונים של הצינור. יישום שיטת שיבוט PIPE תומך בשיטת MTPP כך שהוא מאפשר את הדור של מבנים רבים בתבנית 96, גם ללא צעדי טיהור עתירי עבודה. שיוך שיבוט צינור עם היכולת לנתח ביטוי חלבון באותה מתכונת 96, גם (Caliper המעבדהשבב 90) עוד יותר מזרז את הזרימה הכוללת. הזיווג של שיטות אלה מאפשר זיהוי מהיר של מבנים המייצרים חלבון מסיס אשר מבטיח את ההצלחה של ייצור חלבון בקנה מידה גדול וטיהור. היבט חיוני להצלחה של התפוקה גבוהה MTPP הוא אמצעים לחלבון (פטנט אמריקאי מס 6,818,060, אמרלד ביו) מכשיר. אמצעים לחלבון הוא מערכת כרומטוגרפיה נוזלית במקביל ערוץ 24 שפותחה במיוחד כדי להגביר את היעילות של ייצור חלבון תפוקה גבוהה ויישומי מחקר הגנומי צינור המבני בנושא. באמצעות הפרוטוקול שתואר קודם לכן להכנת החלבון, היתרונות ניכרים בהשוואה למערכת FPLC שורה אחת. אדם אחד יכול לטהר עד 48 מטרות במקביל בתוך תקופה של שמונה שעות ביממה. בניגוד לכך, אדם יחיד באמצעות מערכת FPLC שורה אחת יכול רק לטהר את מקסימום של ארבע מטרות בתוך פרק הזמן זהה. הרמות הגבוהות של טוהר לכל יעדלהשיג עם אמצעים לחלבון הם גורם קריטי בהצלחה בהמשך של גבישי חלבון גוברים לניתוח מבנה. מגבלות ופתרון בעיות פתרון מבנים תלת ממדי על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן הוא מאמץ רב מבוים עם אתגרים רבים, שאחד מהם הוא חוסר היכולת להשיג כמויות גדולות של חלבון המטרה מסיס. אסטרטגיה אחת שיכול להיות מיושמות כדי להתגבר על הבעיה המסיסות היא השימוש בביטוי מארח כחלופת א &#39; קולי תאים אינכם מצליחין לבצע כמה שינויים לאחר translational אוקריוטים חשובים. ביטוי בשמרים שונים, שורות תאי חרקים ויונקות, כי הם מסוגלים לבצע לאחר translational השינויים הללו הם לעתים קרובות חלופה מתאימה. חלבוני יעד לפעמים באים לידי ביטוי אך לא מסיס לחלוטין בתנאי תמוגה הסטנדרטיים. אמצעים לחלבון יכול להיות משאב יקר ערך עבור הבדיקה המהירה של תנאי תמוגה תא חלופייםכפי שמתואר בסמית et al. 2011 13. אסטרטגיה זו היא לעתים קרובות הכרחית כדי לשמור על מטרות נעות דרך הצינור. בכל צינור גנומיקה מבני, פרוטוקולים סטנדרטיים לא יכולים להיות מתאימים לכל יעד שמגיע דרך הצינור ומטרות עשויות להזדקק לאופטימיזציה של פרט. לדוגמה, בחרו להשתמש 20% אתילן גליקול לכל cryoprotectant. במקרים שהמצב הזה הוא לא מתאים, או ריכוזי cryoprotectants החלופיים ייתכן שיצטרכו להיבדק. בשל האופי הייחודי של כל יעד חלבון בודד, שער הגבלת וצעד בלתי צפוי בקביעת מבנה הוא התגבשות. את קיזוז צינור MTPP שיעור ההצלחה הנמוך בדרך כלל מהתגבשות חלבון עם אופטימיזציה ממסכי המטריצה ​​הדלילות הראשוניים. כל גביש ראשוני נפגע ממסכי מטריצה ​​דלילים זמינים מסחרי הוא מותאם יותר עם בונה דואר מסך (אמרלד ביו). לאופטימיזציה של המסך נועד ARound מצבו של להיט הגביש הראשוני, לשנות את הריכוזים של המאגרים, המלחים, ותוספים. מסכי אופטימיזציה מוצלחות להניב גבישים המתאימים לעקיפים מחקרים וקביעת מבנה. תכנית גנומיקה המבנית אשר נקבעו על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) מספקת מימון לאמרלד ביו ושלושה מוסדות מערב האוקיינוס ​​השקט אחרים שיחד הם SSGCID (אמרלד ביו, SeattleBiomed, אוניברסיטת וושינגטון וPacific Northwest National Laboratory) . כל אחד מחברי הקונסורציום נבחר למומחיות שלהם ביישום טכנולוגיות מדינה-of-the-art הנדרשות להשגת המטרות של תכנית גנומיקה המבנית NIAID. נכון להיום, SSGCID הפקידה 461 מבנים לדירוג PDB כתורם הגדול ביותר השביעי בעולם, ובשנת 2011, הפורה ביותר. הפרוטוקולים ומתודולוגיות של SSGCID מסופקים עם הכוונה לטובתקהילה מדעית ומנציח את המחקר במחלות זיהומיות.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

התפרצויות מגיפה של זני שפעת אלימים ביותר יכולות לגרום לתחלואה ותמותה נרחבות באוכלוסיות אדם ברחבי העולם. בארצות הברית בלבד, ממוצע של 41,400 מקרי מוות ו 1.86 מיליון אשפוזים נגרמים על ידי זיהום בנגיף שפעת בכל שנה 1. מוטציות נקודתיות בחלבון למקטע 2 הבסיסי פולימראז (PB2) נמצאו קשורה להסתגלות של הזיהום הנגיפי בבני אדם 2. ממצאים ממחקרים כאלה גילו את המשמעות הביולוגית של PB2 כגורם ארסיות, ובכך מדגישים את הפוטנציאל שלה כיעד תרופה אנטי. תכנית גנומיקה המבנית אשר נקבעו על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) מספקת מימון לאמרלד ביו ושלושה מוסדות מערב האוקיינוס ​​השקט אחרים שיחד מרכיבים את מרכז ג&#39;נומיקס המבני סיאטל למחל זיהומיות (SSGCID). SSGCID מחויבת לספק לקהילה המדעית עם threמבנים חלבוניים דואר ממדי של פתוגנים NIAID הקטגוריה AC. מה שהופך את המידע כזה מבני זמין לקהילה המדעית משמש להאצת תכנון תרופות המבוסס על מבנה. תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בפיתוח תרופה. רודף מטרות מרובות במקביל מגדיל מאוד את הסיכוי להצלחה לגילוי להוביל חדש על ידי מיקוד מסלול או משפחת חלבון כולו. אמרלד יו פיתחה צינור עיבוד מקביל תפוקה גבוהה, רב יעד (MTPP) להגדרת גן למבנה כדי לתמוך בקונסורציום. כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים כדי לקבוע את המבנה של מקטע PB2 מארבע זני שפעת שונה.

את התוצאות הבאות להמחיש את התוצאות הצפויות של הפרוטוקול המתואר, ובמקרה של PB2, את התוצאות שנצפו. באמצעות מלחין ג&#39;ין, חמישה רצפים של חומצות באורך מלא היעד של אמין PB2 מקטע פולימראז נגיף השפעת נועדו (איור 2). את PB2 הרצפים תורגמו בחזרה ונתונים לצעדים רבים הנדסי 3, וכתוצאה מהרצפים ההרמוניים קודון המותאמים לביטוי בE. coli. ממוצרי iPCR (איור 3), סך של שלושים וארבעה מבנים היו משובט בהצלחה למערכת וקטור pET28 שונה 10 עם N-מסוף 6x תג ההיתוך שלו-SMT באמצעות שיבוט PIPE 3, כפי שמוצג באיור 3 א. סיכום של העבודה השיבוט מוצג באיור 4. אחרי שיבוט מוצלח, ביטוי חלבון בקנה מידה מייקרו של כל מבנה נבדק בBL21 (DE3) א &#39;קולי תאים. תאים גודלו במדיום שחפת בתוספת 1 בינונית Novagen לילה Express (על פי הפרוטוקול של היצרן) עבור 48 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בסט רועד חממה ב 220 סל&quot;ד. לאחר צמיחה, תאים נקצרו ונבדקו לביטוי חלבון מסיס באמצעות electrophoreses הנימים עם LabChip Caliper 90. ארבעה עשר מהשלושים וארבעה המבנים PB2 הובילו לחלבון המטרה מסיס ונכנסו תסיסה בקנה מידה גדולה. תרבויות בקנה מידה גדולה של כל אחד מהמושגים שגדלו במדיום שחפת בתוספת בינונית אקספרס לינה של Novagen 1 על פי הפרוטוקול של היצרן. לאחר צמיחה, תאים נקצרו באמצעות צנטריפוגה ומאוחסנים ב -80 ° C. ביטוי חלבון בקנה מידה גדול של כל תרבות ותרבות אישר באמצעות SDS-PAGE ניתוח (איור 5) לפני שימשיך עם טיהור בקנה מידה גדולה. אמצעים לחלבון שימש לביצוע טיהור מקבילה של הארבעה עשרה מבני PB2. את lysates הבהיר של אלמבני ליטר ארבעה עשר היו לרוץ דרך עמודת ניקל chelate. לאחר הקביעה שהכיל שברי חלבון המטרה על ידי-SDS, שברים המקבילים היו נקווה לכל דגימה והריכוז של כל אחד נקבע על ידי קריאה 280. ההסרה של תגו-SMT 6x נערכה על ידי התוספת של ULP1 אחרי דיאליזה הלילה ועמודה שנייה ניקל. אישור על הסרתו התג-SMT נערך על ידי-SDS (איור 6), ומדגם זה היה מרוכז עם צינור צנטריפוגות אולטרה 10 kDa Amicon. לאחר ריכוז באמצעות צינורות צנטריפוגה Ultra Amicon, כל דגימה נדרסה עמודה אומדת להשיג טוהר קריסטלוגרפיים. ריכוז שני נערך להגדיל את ריכוז החלבון לרמה הכרחית להתגבשות. כל ארבע עשרה המבנים היו מטוהרים בהצלחה ונכנסו לתוך ניסויי התגבשות. הגיבוש נערך ביוזמת הפשרת FR בעברחלבון אוזן. הגיבוש נערך בחדר מבוקר אקלים על 16 מעלות צלזיוס עם צלחות, שתוכננו במיוחד (אמרלד ביו) לישיבת דיפוזיה אדי טיפה (איור 7). סינון ראשוני נערך עם ארבעה מסכי דלילים-מטריקס; JCSG +, ברית, אשף מלא, וCryoFull (אמרלד ביו), בעקבות אסטרטגיית ניומן מורחבת. 0.4 μl של תמיסת חלבון היה מעורב אז עם 0.4 μl של crystallant (או פתרון מאגר) מהמאגר המקביל באמצעות צלחות התגבשות ג&#39;וניור 96, גם קומפקטיות (אמרלד ביו). מהארבעה עשר הדגימות מטוהרות תשעה מהם הניבו גבישים מתאימים ללימודים עקיפה (איור 8). ערכת נתונים עקיפה בבית נאספה בחמישה מתוך תשעת המבנים התגבשו בCu Kα אורך הגל באמצעות גנרטור Rigaku superbright FR-E + מסתובב-האנודה רנטגן המצויד Osmic VariMax אופטיקה HF ו 944 + גלאי CCD שבתאי (איור 9 ). כל סט הנתונים מעובד עם XDS / XScale 4 &lt;<html> / Sup&gt; וטפס להחלטה סופית. ניסיונות לפתור את המבנים על ידי החלפה מולקולרית בוצעו עם Phaser 5 מCCP4 חבילת 7. הדגמים הסופיים התקבלו לאחר העידון בREFMAC 7 ובנייה מחדש ידנית עם 11 הקרסול. המבנים הוערכו ותיקן לגיאומטריה וכושר עם MolProbity 9. כוללת של ארבעה מבנים של מקטע PB2 נקבעו (איור 10) והופקד לPDB. איור 11 מדגים את התוצאה הכללית בכל שלב בצנרת MTPP. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> איור 1. סקירה כללית של מסלול גן למבנה SSGCID לעיבוד מקביל מרובה היעד באמרלד ביו. <html> תוכן &quot;עבור: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> איור 2. מציג יישור וחלבון לבנות מודול עיצוב בתוכנת מלחין ג&#39;ין. בסיס חומצה אמינית לבנות של היעד מוצג בירוק (חלון באמצע) ואת truncations מודרך המבנה של מבנים חלופיים מוצגות בזהב (חלון תחתון). יישור של רצפים נגיפיים שפעת PB2 מרובים מוצג בהשוואה לרצף ואלמנטי מבנה משניים של התחום בטרמינל C-מ3CW4 PDBID. ידע של מבנה התחום ואלמנטי מבנה משניים מאפשר truncations N-מסוף להיבחר בתוך מודול עיצוב מלחין הגן על ידי לחיצה ימנית על שאריות חומצת אמינו הרצויה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> ithin עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 3 א" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3a.jpg" /> איור 3 א. שיבוט צינור מאויר בי להכניס את הגן הסינטטי (כתום) מוגבר על ידי תוכנן קדימה (קווים אדומים כתומים) ופריימרים (קווים כחולים, כתום) הפוכים כדי ליצור להכניס חומר PCR. וקטור הביטוי מוגבר עם קווים הפוך (אדומים שחורים פריימרים) וקדימה (קווים כחולים שחורים) כדי ליצור חומר PCR וקטור. מוצרי iPCR רצפי מסופים משלימים לרצפי הטרמינל של מוצרי vPCR (האדום של iPCR משלים אדום של vPCR והכחול של iPCR משלימים כחולים של vPCR). זה מאפשר את מוצרי iPCR וvPCR כדי לחשל כדי ליצור פלסמידים שמשוכפלים על הפיכתו מארח BL21 (DE3) א &#39;כימי המוסמכת קולי תאים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> איור 3. ניתוח agarose ג&#39;ל של iPCR produc<html> כישלונות iPCR ts ממקטע PB2. ניתן לראות להקות חלשות או מוכתמות, ואילו מוצרי iPCR מוצלחים מיוצגים על ידי להקות חזקות. איכות מוצר בדרך כלל iPCR יכולה להיות מתואמת עם הצלחה שיבוט. סמני משקל מולקולריים הם בkiloDaltons. איור הוא לשכפל מריימונד et al., 2011 12. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> איור 4. צעדי הנדסה גנטיים של חלבוני היעד PB2 בוצעו באמצעות תוכנת מלחין ג&#39;ין. לאחר רצף חומצות הגרעין המהונדס הוקם עבור כל יעד, מבני חלבונים חלופיים 6-7 נועדו לכל אחד. עיבוד מקביל רב היעד בשלבים הראשוניים של עיצוב גן והביא לשיבוט 34 מבנים, 14 מהם היו מטרות קיימא שמיוצרות חלבונים מסיסים בE. coli. <html> מחדש 5 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; איור 5. SDS-PAGE ניתוח נציג של תסיסה בקנה מידה גדולה מראה ביטוי חלבון חזק (גודל צפוי של 25.76 KDA), מחשוף בערך 50% מסיס (מסלול 4) וכ -50% מתג שלו 6x-SMT מחלבון eluted (מסלול 7). <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> איור 6. תוצאות-SDS לשלושה מבנים של מקטע PB2 פולימראז 1 ליין, סמנים מולקולרי משקל (מסומן בצד השמאל בKDA); נתיבים. 2, 6, ו -10, חלבון ונקווה מעמודת ניקל 1; 3 נתיבים, 7 ו 11, זרימה דרכו של חלבון ביקע במאגר מניקל 2; נתיבי 4, 8, ו -12, הסרת התג 6x-SMT בB החיץ מניקל 2. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; איור 7. סכמטית של דיפוזיה אדים בשיטת הטיפה יושבת. שיטת הטיפה יושבת להתגבשות חלבון נופל תחת הקטגוריה של דיפוזיה האדים. שיטה זו כרוכה במדגם של חלבון מטוהר ונמהר כדי לאזן עם מאגר גדול יותר המכיל תנאים דומים בריכוז גבוה יותר. כמו מים מאדים ממדגם החלבון וההעברות למאגר, הריכוז נמהר מגביר לרמה אופטימלית להתגבשות חלבון. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> איור 8. גביש חלבון של מקטע פולימראז PB2 מזן של נגיף השפעת. <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> איור 9. תמונת השתברות קרן ה-X של המקטע מפולימראז PB2זן של נגיף השפעת. <img alt="איור 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> איור 10. דיאגרמות של רצועת הכלים של המולקולות ביחידה אסימטרית קריסטלוגרפיים של 4 PB2 מבני מבנים משניים. צבעוניים בדפוס קשת עם קודי PDB מתאימים. (א) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (ב) 3KHW (/ מקסיקו / InDRE4487/2009/H1N1) (ג) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (ד) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="איור 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> איור 11. ניתוח תוצאות למטרות שפעת PB2 על ידי השיטות שתוארו. structurצינור נחישות הדואר בא לידי ביטוי בחמישה שלבים: שיבוט, מסיסות, טיהור, התגבשות מבנה ונחישות.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בפיתוח תרופה. רודף מטרות מרובות במקביל מגדיל מאוד את הסיכוי להצלחה לגילוי עופרת. המאמר הבא מדגיש עד כמה מרכז ג&#39;נומיקס המבני סיאטל למחל זיהומיות מנצל גישה רב יעד לקביעת גן למבנה של שפעת PB2 מקטע.

גישת עיבוד מקביל רב היעד לקביעת גנטי למבנה של פולימראז שפעת PB2 מקטע

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...