Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del consorzio SSGCID. Raggiungimento degli obiettivi del SSGCID è reso possibile dagli enormi sforzi di tutti i membri del team a Emerald Bio. Questa ricerca è stata finanziata nell&#39;ambito federale contratto n HHSN272200700057C presso l&#39;Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive, il National Institutes of Health e il Dipartimento di Salute e Servizi Umani.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

Gli autori sono dipendenti di Emerald Bio, Inc.

Multi-Target Parallel Processing Structure-based drug design gioca un ruolo importante nella scoperta di nuovi farmaci. Il SSGCID è dedicato a fornire alla comunità scientifica con strutture proteiche a tre dimensioni da NIAID categoria patogeni AC. Rendere tali informazioni strutturali ampiamente disponibili in ultima analisi, servirà ad accelerare la struttura basata progettazione di farmaci. Il primo passo fondamentale dell&#39;approccio MTPP è il design costrutto. Molteplici i costrutti di ogni proteina bersaglio aumenta la probabilità di determinazione della struttura di successo e gli aumenti di turnaround. E &#39;inevitabile che alcuni costrutti proteici mancheranno durante fasi della pipeline. Attuazione del metodo di clonazione TUBO supporta il metodo MTPP consentendo la generazione di molti costrutti in formato a 96 pozzetti senza lavoro intensivo fasi di purificazione. TUBO clonazione abbinamento con la capacità di analizzare l&#39;espressione della proteina nello stesso formato a 96 pozzetti (Pinza LabChip 90) accelera ulteriormente il flusso complessivo. L&#39;accoppiamento di questi metodi consente una rapida identificazione di costrutti che producono proteina solubile che assicura il successo della produzione di proteina su larga scala e purificazione. Un aspetto essenziale per il successo del MTPP alta produttività è la proteina Maker (US Patent No. 6.818.060, smeraldo Bio) strumento. La proteina Maker è un sistema di cromatografia liquida-parallelo 24 canali sviluppata specificamente per aumentare l&#39;efficienza della produzione di proteine ​​ad alta velocità e relative applicazioni strutturali genomiche di ricerca condotte. Utilizzando il protocollo precedentemente descritto per la proteina Maker, i vantaggi sono evidenti in confronto ad un unico sistema FPLC riga. Una singola persona può purificare fino a 48 bersagli in parallelo all&#39;interno di un periodo di otto ore. Al contrario, una sola persona con un unico sistema FPLC linea può purificare solo un massimo di quattro bersagli entro il medesimo termine. Gli alti livelli di purezza per ogni targetrealizzato con la proteina Maker sono un fattore critico nel successo di seguito la crescita di cristalli di proteine ​​per l&#39;analisi della struttura. Limitazioni e risoluzione dei problemi Solving strutture tridimensionali da cristallografia a raggi x è uno sforzo plurifase con molte sfide, uno dei quali è l&#39;impossibilità di ottenere grandi quantità di proteina solubile bersaglio. Una strategia che può essere implementato per superare il problema solubilità è l&#39;uso di un host espressioni alternative come E. coli sono in grado di eseguire diversi importanti eucariotici modificazioni post-traduzionali. Espressione in varie lievito, linee cellulari di insetto e di mammifero, che sono in grado di eseguire queste modificazioni post-traduzionali sono spesso una valida alternativa. Proteine ​​bersaglio a volte sono espressi, ma completamente insolubile in condizioni di lisi standard. La proteina Maker può essere una risorsa preziosa per il test rapido di condizioni alternative lisi cellularecome descritto in Smith et al. 2011 13. Questa strategia è spesso necessario per mantenere bersagli in movimento attraverso la conduttura. In ogni pipeline di genomica strutturale, protocolli standardizzati possono non essere adatti per ogni obiettivo che passa attraverso la pipeline e gli obiettivi possono avere bisogno di ottimizzazione individuale. Per esempio, abbiamo scelto di utilizzare il 20% di glicole etilenico per ogni cryoprotectant. Nei casi in cui questa condizione non è adatto, crioprotettivi alternativi o concentrazioni possono avere bisogno di essere testati. A causa della natura unica di ogni singolo obiettivo della proteina, il fattore limitante e step imprevedibili nella determinazione di una struttura è cristallizzazione. Gli offset conduttura MTPP il tasso di successo comunemente basso di cristallizzazione delle proteine ​​con l&#39;ottimizzazione delle schermate iniziali matrici sparse. Ogni cristallo iniziale colpito dagli schermi matrici sparse in commercio è ulteriormente ottimizzata con un Builder E-Screen (Emerald Bio). La schermata di ottimizzazione è progettato around la condizione della hit cristallo iniziale, alterando le concentrazioni dei tamponi, sali e additivi. Schermate di ottimizzazione di successo producono cristalli adatti per studi di diffrazione e la determinazione della struttura. Il programma di genomica strutturale messo avanti dall&#39;Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID) finanzia Emerald Bio e di altri tre istituti del Nord-Ovest del Pacifico, che insieme sono la SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, l&#39;Università di Washington e il Pacific Northwest National Laboratory) . Ciascun membro del consorzio è stato scelto per la loro esperienza nell&#39;applicazione di tecnologie state-of-the-art necessari per realizzare gli obiettivi del programma di genomica strutturale NIAID. Ad oggi, SSGCID ha depositato 461 strutture nel ranking PDB come il settimo più grande contributore al mondo, e nel 2011, il più produttivo. I protocolli e le metodologie della SSGCID sono forniti con l&#39;intenzione di beneficiare delcomunità scientifica e perpetuare la ricerca di malattie infettive.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

Pandemie influenzali di ceppi altamente virulenti possono causare morbilità e mortalità diffusa nelle popolazioni umane in tutto il mondo. Negli Stati Uniti da soli, una media di 41.400 morti e 1.860.000 ricoveri sono causati da infezione da virus influenzale ogni anno 1. Le mutazioni puntiformi nel polimerasi di base delle proteine ​​2 subunità (PB2) sono stati collegati all&#39;adattamento dell&#39;infezione virale nell&#39;uomo 2. I risultati di tali studi hanno rivelato il significato biologico di PB2 come un fattore di virulenza, evidenziando in tal modo il suo potenziale come bersaglio di un farmaco antivirale. Il programma di genomica strutturale messo avanti dall&#39;Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID) finanzia Emerald Bio e di altre tre istituzioni Pacific Northwest che insieme costituiscono il centro di Seattle Genomica strutturale per malattie infettive (SSGCID). Il SSGCID è dedicato a fornire alla comunità scientifica di tre Tepstrutture proteiche e-dimensionali del NIAID categoria patogeni AC. Rendere tali informazioni strutturali a disposizione della comunità scientifica serve per accelerare la struttura basata su drug design. Structure-based drug design gioca un ruolo importante nello sviluppo di farmaci. Perseguire obiettivi multipli in parallelo aumenta notevolmente la probabilità di successo per la nuova scoperta di piombo di mira una via o di una intera famiglia di proteine. Emerald Bio ha sviluppato una pipeline di elaborazione parallela ad alta velocità, multi-target (MTPP) per la determinazione del gene-per-struttura a supporto del consorzio. Qui si descrivono i protocolli utilizzati per determinare la struttura della subunità PB2 da quattro influenza diversa A ceppi.

I seguenti risultati illustrano i risultati attesi del protocollo descritto, e nel caso delle PB2, i risultati osservati. Utilizzando Gene compositore, cinque full-length bersaglio sequenze amminoacidiche del virus influenzale polimerasi subunità PB2 stati progettati (Figura 2). Le sequenze PB2 sono stati tradotti indietro e sottoposti a molte fasi di engineering 3, con conseguente codone sequenze armonizzate ottimizzati per l&#39;espressione in E. coli. Dai prodotti IPCR (Figura 3b), per un totale di trentaquattro costrutti sono stati clonati con successo in un sistema modificato pET28 vettore 10 con un N-terminale 6x His-tag Smt fusione utilizzando PIPE clonazione 3 come mostrato in figura 3a. Una sintesi del flusso di lavoro clonazione è presentato in Figura 4. Dopo la clonazione successo, l&#39;espressione della proteina micro-scala di ciascun costrutto è stato testato in BL21 (DE3) E.coli. Le cellule sono state coltivate in terreno supplementato con TB Novagen Overnight Express 1 medio (secondo il protocollo del produttore) per 48 ore a 20 ° C in un incubatore set agitazione a 220 rpm. Dopo la crescita, le cellule sono state raccolte e testate per l&#39;espressione della proteina solubile usando elettroforesi capillare con una pinza LabChip 90. Quattordici dei trentaquattro PB2 costrutti portato solubile proteina bersaglio ed è entrato fermentazione su larga scala. Colture su larga scala di ciascun costrutto sono state coltivate in terreno TB integrato con Overnight Express 1 media di Novagen secondo il protocollo del produttore. Dopo la crescita, le cellule sono state raccolte tramite centrifugazione e conservati a -80 ° C. Espressione proteica su larga scala di ogni coltura è stata confermata mediante analisi SDS-PAGE (Figura 5) prima di procedere con la purificazione su larga scala. La proteina Maker è stato usato per condurre purificazione parallelo dei quattordici costrutti PB2. I lisati chiarito di all quattordici costrutti sono stati eseguiti attraverso una colonna di nichel-chelato. Dopo aver determinato quali frazioni conteneva proteina bersaglio mediante SDS-PAGE, le corrispondenti frazioni sono state miscelate per ciascun campione e la concentrazione di ciascun stato determinato da un Una lettura 280. Rimozione del tag His-Smt 6x è stato condotto con l&#39;aggiunta di ULP1 seguita da dialisi durante la notte e una seconda colonna di nichel. La conferma della rimozione His-tag Smt stato condotto mediante SDS-PAGE (Figura 6), e ciascun campione è stato concentrato con un kDa Amicon Ultra tubo da centrifuga 10. Dopo la concentrazione utilizzando i tubi Ultra centrifuga Amicon, ogni campione è stato eseguito su una colonna dimensionamento per raggiungere la purezza cristallografica. Una seconda concentrazione è stato condotto per aumentare la concentrazione proteica al livello necessario per la cristallizzazione. Tutti i quattordici costrutti sono stati purificati con successo e sono entrati in prove di cristallizzazione. La cristallizzazione è stata avviata da scongelamento la precedenza frproteine ​​ozen. Cristallizzazione è stata eseguita in una camera climatica controllata a 16 ° C con piastre appositamente progettati smeraldo (Bio) per seduta goccia diffusione del vapore (Figura 7). Screening iniziale è stato condotto con quattro schermi a matrice sparsa; JCSG +, Patto, guidata completa, e CryoFull (Emerald Bio), a seguito di una strategia di Newman estesa. 0,4 ml di soluzione proteica è poi mescolato con 0,4 ml di crystallant (o soluzione serbatoio) dal serbatoio corrispondente utilizzando piastre di cristallizzazione Jr 96 pozzetti compatti (Emerald Bio). Dei quattordici campioni purificati nove di loro fruttato cristalli adatti per studi di diffrazione (Figura 8). Un in-house insieme di dati di diffrazione sono stati raccolti su cinque dei nove costrutti cristallizzati in Cu Kα lunghezza d&#39;onda utilizzando un SuperBright FR-E generatore di raggi X + rotante-anodo Rigaku dotato Osmic VariMAX HF ottica e un 944 rilevatore di Saturno + CCD (Figura 9 ). Ogni set di dati è stato elaborato con XDS / XSCALE 4 &lt;<html> / Sup&gt; e la scalata a una risoluzione definitiva. Tentativi di risolvere le strutture tramite sostituzione molecolare sono state effettuate con Phaser 5 dalla CCP4 Suite 7. I modelli finali sono stati ottenuti dopo affinamento in REFMAC 7 e ricostruzione manuale con Folaga 11. Le strutture sono stati valutati e corretti per la geometria e la forma fisica con MolProbity 9. Un totale di quattro strutture della subunità PB2 sono stati determinati (Figura 10) e depositato nel PPB. Figura 11 illustra il risultato complessivo in ogni fase della pipeline MTPP. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica del SSGCID via gene-per-struttura per l&#39;elaborazione in parallelo multi-target a Emerald Bio. contenuto &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> Figura 2. Visualizzatore di allineamento e proteine ​​Costruire Design del modulo nel software Composer Gene. Base di aminoacidi costrutto di destinazione viene visualizzato in verde (finestra centrale) e la struttura troncamenti guidate di costrutti alternativi sono indicati in oro (finestra in basso). L&#39;allineamento di più sequenze virali influenzali PB2 è mostrato rispetto alla sequenza ed elementi di struttura secondaria del dominio C-terminale dal 3CW4 PDBID. La conoscenza della struttura di dominio e di elementi di struttura secondaria permette troncamenti N-terminale a scelta all&#39;interno del Compositore Modulo Progettazione Gene facendo clic destro sul residuo desiderato aminoacido. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . Figura 3a. PIPE clonazione è illustrato in cui l&#39;inserto gene sintetico (arancione) è amplificata dal progettati in avanti (linee rosso-arancio) e inversa (linee arancione e blu) primer per generare inserire materiale PCR. Il vettore di espressione è amplificato con linee inverso (rosso-nero ) e in avanti (linee blu-nero) primer per generare vettore materiale PCR. Le sequenze terminali prodotti IPCR sono complementari alle sequenze terminali dei prodotti vPCR (rosso di IPCR complementi rosso di vPCR e blu di IPCR complementi blu di vPCR). In questo modo i prodotti IPCR e vPCR per temprare a formare plasmidi che vengono replicati su di trasformazione in serie BL21 (DE3) chimicamente competente E. coli. <img alt="Figura 3b" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> Figura 3b. Agarosio analisi del gel di IPCR produzione<html> ts dalla subunità PB2. fallimenti IPCR possono essere visti come bande deboli o untuosa, mentre i prodotti IPCR di successo sono rappresentati da bande robusti. IPCR qualità del prodotto può generalmente essere correlata con successo clonazione. Marcatori di peso molecolare sono in chilodalton. La figura è riprodotto da Raymond et al., 2011 12. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> Figura 4. Gene fasi di engineering del bersaglio le proteine ​​PB2 sono state eseguite utilizzando il software Composer Gene. Dopo la sequenza di acido nucleico di ingegneria è stato stabilito per ogni target, 6-7 costrutti proteici alternativi sono stati progettati per ciascuno. Elaborazione in parallelo multi-target nelle fasi iniziali di progettazione genetica e la clonazione ha provocato 34 costrutti, 14 dei quali erano gli obiettivi vitali che producevano proteine ​​solubili in E. coli. <html> re 5 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Rappresentante SDS-PAGE analisi di fermentazione su larga scala che mostra l&#39;espressione della proteina robusto (dimensione prevista di 25,76 kDa), circa il 50% solubile (corsia 4) e circa il 50% scissione del tag 6x His-Smt da proteine ​​eluite (corsia 7). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> Figura 6. Risultati di SDS-PAGE per tre costrutti della polimerasi subunità PB2 corsia 1, marcatori di peso molecolare (etichettati a sinistra in kDa),. Corsie 2, 6, e 10, proteina aggregata da Nickel 1 colonna; corsie 3, 7 e 11, flusso continuo di proteine ​​spaccati in tampone A da Nickel 2; corsie 4, 8, e 12, la rimozione del tag 6x His-Smt in tampone B da nichel 2. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Uno schema di diffusione del vapore con il metodo goccia seduta. Metodo goccia seduta per la cristallizzazione delle proteine ​​rientra nella categoria di diffusione del vapore. Questo metodo comporta una campione purificato di proteine ​​e precipitante equilibrare con un serbatoio più grande contenente condizioni simili in una concentrazione più alta. Come l&#39;acqua evapora dal campione proteico e trasferisce al serbatoio, la concentrazione precipitante aumenta ad un livello ottimale per la cristallizzazione della proteina. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> Figura 8. Cristallo di proteina PB2 subunità della polimerasi da un ceppo del virus influenzale. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> Figura 9. Immagine di diffrazione di raggi X della polimerasi PB2 da una subunitàceppo del virus influenzale. <img alt="Figura 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> La figura 10. Diagrammi Ribbon delle molecole nell&#39;unità asimmetrica cristallografica di 4 PB2 strutture. Strutture secondarie colorate nel modello arcobaleno con i corrispondenti codici PDB. (A) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / Messico / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="Figura 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> Figura 11. Analisi di outcome per l&#39;influenza PB2 obiettivi con i metodi descritti. L&#39;structurpipeline di determinazione e è illustrato in cinque fasi: determinazione Clonazione, solubilità, purificazione, cristallizzazione e struttura.

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Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

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