Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
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著者はSSGCIDコンソーシアムのすべてのメンバーに感謝したいと思います。 SSGCIDの目標の達成は、エメラルドバイオのすべてのチームメンバーの多大な努力によって実現されています。本研究では、アレルギーと国立感染症研究所からの連邦契約番号HHSN272200700057C、健康と保健社会福祉省の国立研究所で賄われていた。

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

著者はエメラルドバイオ社の従業員である

マルチターゲット並列処理構造に基づいたドラッグデザインは、創薬に重要な役割を果たしている。 SSGCIDはNIAIDカテゴリAC病原体から3次元タンパク質構造と科学界に提​​供することに専念している。広く利用可能な構造情報を作ることは、最終的に構造ベースの薬物設計を加速するのに役立つでしょう。 MTPPアプローチの最初の重要なステップは、構造設計です。各標的タンパク質の複数の構築物は、成功した構造決定を増加させ、ターンアラウンドの確率を増加させる。これは、いくつかのタンパク質構造は、パイプラインの各ステージ中に失敗することは避けられません。 PIPEクローニング法を実装すると、労働集約的な精製工程なしで96ウェルフォーマットの多くの構成要素の生成を可能にすることによってMTPP方法をサポートしています。同じ96ウェルフォーマット（キャリパーラボにおけるタンパク質発現を分析する能力をPIPEクローニングのペアリングチップ90）はさらに、全体の流れを迅速に。これらの方法の組み合わせは、大規模タンパク質産生および精製の成功を保証する可溶性タンパク質を生産する構築物の迅速な同定を可能にする。 MTPP高スループットの成功に重要な側面は、プロテインメーカー（米国特許第6818060、エメラルドバイオ）機器です。プロテインメーカーは、高スループットのタンパク質生産および関連構造ゲノムパイプラインの研究アプリケーションの効率性を高めるために特別に開発された24チャンネル並列液体クロマトグラフィーシステムです。タンパク質メーカーについて以前に記載されたプロトコルを使用して、利点は、単一のラインFPLCシステムと比較して明らかである。一人は、8時間の期間内に並列に48のターゲットにまで浄化することができる。対照的に、単一のラインFPLCシステムを使用して一人は、同じ期間内の最大4つのターゲットを浄化することができる。各ターゲットの純度の高いレベルプロテインメーカーで達成構造解析のために成長しているタンパク質結晶の後の成功の重要な要因である。 制限事項およびトラブルシューティング X線結晶学によって三次元構造を解決する可溶性標的タンパク質を大量に得ることができないことである一つは多くの課題を有する多段努力である。溶解度の問題を克服するために実施することができる1つの戦略はE.などの代替の発現宿主の使用である大腸菌細胞は、いくつかの重要な真核翻訳後修飾を行うことができない。様々な酵母での発現は、これらの翻訳後修飾は、しばしば適切な代替である実行することができる昆虫および哺乳類細胞株。標的タンパク質は、時には発現が、標準的な溶解状態で完全に不溶性である。プロテインメーカーは、代替細胞溶解条件の迅速なテストのための貴重なリソースとなることができますとしてSmith らで説明。 2011 13。この戦略は、多くの場合、ターゲットは、パイプラインを介して動き続けることが必要である。任意の構造ゲノミクスのパイプラインでは、標準化されたプロトコルは、パイプラインと目標は、個々の最適化が必要になることがあり伝わってくるすべての目標のために適していないかもしれません。例えば、我々は、すべての凍結防止剤、20％エチレングリコールを使用することを選択した。この条件は適していないことのケースでは、代替の凍結保護剤又は濃度が試験される必要があるかもしれません。 個々のタンパク質標的のユニークな性質により、律速と構造を決定するステップは、予測不可能な結晶である。初期の疎行列の画面から最適化タンパク質結晶化のMTPPパイプラインオフセットは、一般的に低い成功率。市販のスパース行列の画面からヒット各初期結晶はさらにE-スクリーン·ビルダー（エメラルドバイオ）で最適化されています。最適化画面はARに設計されています緩衝液、塩、および添加剤の濃度を変える、初期結晶ヒットの状態をoundここ。成功した最適化画面は回折研究と構造決定に適した結晶を得ることができます。 アレルギー感染症研究所（NIAID）で出す構造ゲノミクスプログラムはエメラルドバイオと一緒にSSGCID（エメラルドバイオ、SeattleBiomed、ワシントン大学、パシフィックノースウェスト国立研究所）は他の3つの太平洋岸北西部機関に資金を提供しています。コンソーシアムの各メンバーは、NIAID構造ゲノミクスプログラムの目標を達成するために必要な最先端の技術を適用することで彼らの専門知識のために選ばれた。現在までに、SSGCIDは世界第7位貢献としてPDBランキングそれに461の構造を堆積しており、2011年に、最も生産。 SSGCIDのプロトコルと方法論は恩恵を受けてのつもりで用意されてい科学界と感染症の研究を永続。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

強毒性インフルエンザのパンデミック発生は、世界中の人間の集団における広範な罹患率と死亡率を引き起こす可能性があります。米国だけでも、41,400人が死亡し、186万入院の平均は、毎年1インフルエンザウイルス感染によって引き起こされます。ポリメラーゼ塩基性タンパク質2サブユニット（PB2）における点突然変異はヒトの2におけるウイルス感染の適応にリンクされている。このような研究から得られた知見は、このように抗ウイルス薬ターゲットとしての可能性を強調し、病原性因子としてPB2の生物学的意義を明らかにした。 アレルギー感染症研究所（NIAID）で出す構造ゲノミクスプログラムはエメラルドバイオと一緒に感染症（SSGCID）がシアトル構造ゲノム科学センターを構成する他の3つの太平洋岸北西部機関に資金を提供しています。 SSGCIDはTHREと科学コミュニティを提供することに専念してNIAIDカテゴリAC病原体の電子次元タンパク質構造。科学コミュニティが利用できるような構造情報を作ることは構造に基づく薬物設計を加速するのに役立つ。 構造に基づいたドラッグデザインは、薬物開発において重要な役割を果たしている。並行して複数のターゲットを追求すると、大幅に経路または全体のタンパク質ファミリーをターゲットにして、新しいリード発見のための成功の可能性が高くなります。エメラルドバイオコンソーシアムをサポートするための遺伝子の構造決定のための高スループット、マルチターゲット並列処理パイプライン（MTPP）を開発した。ここでは、4つの異なるインフルエンザ株からPB2サブユニットの構造を決定するために使用されるプロトコルを説明する。

次の結果が記述されたプロトコルの期待される結果を示しており、PB2、観測された結果の場合には遺伝子Composerを用いて、インフルエンザウイルスポリメラーゼサブユニットPB2の5の全長標的アミノ酸配列（ 図2）を設計した。 PB2シーケンスはバック翻訳多くの工学のステップ3を行い、E.での発現のために最適化されたコドン調和シーケンスになりましコリ。iPCRを製品（ 図3b）、三〇から四構築物の総加入に成功し、図3aに示すように、PIPEクローニング3を用いたHis-Smtを融合タグはN末端​​6×有する変性pET28ベクター系10にクローニングした。クローニングワークフローの概要は図4に示されている。 クローニングの成功後、各構築物のマイクロスケールのタンパク質発現は、BL21（DE3） 大腸菌で試験した大腸菌細胞。細胞を220 rpmで振盪インキュベーター·セットに20℃で48時間Novagen社物エクスプレス1媒体（製造業者のプロトコルに従って）を補充したTB培地中で増殖させた。成長後、細胞をラボチップキャリパー90がキャピラリ電気泳動を用いて可溶性タンパク質の発現のために採取し、試験した。可溶性の標的タンパク質につながったと三〇から四PB2構文の14は、大規模な発酵に入った。各構築物の大規模な培養物を製造業者のプロトコルに従ってNovagen社のエクスプレス物1媒体を補充TB培地中で増殖させた。成長後、細胞を遠心分離によって回収し、-80℃で保存した。各培養物の大規模タンパク質の発現は、大規模精製を開始する前に、SDS-PAGE分析（ 図5）を介して確認した。 タンパク質メーカーは14 PB2構築物の並列精製を実施するために使用された。アルの明確化ライセートL 14構築物は、ニッケルキレートカラムに通した。 SDS-PAGEによる標的タンパク質を含有する画分を決定した後、対応する画分を各試料についてプールし、それぞれの濃度は、280読み取りにより測定した。 6×彼-SMTタグの除去は、一晩透析し、第二ニッケルカラム、続いてULP1を添加することによって行った。彼-SMTタグ除去の確認は、SDS-PAGE（ 図6）により行い、各サンプルは10 kDaのアミコンウルトラ遠心管で濃縮した。アミコンウルトラ遠心管を​​使用して濃縮した後、各サンプルは結晶純度を達成するためのサイジングカラムに実行されました。第2の濃度は、結晶化に必要なレベルにタンパク質濃度を増加させるために実施した。すべての14の構築物を成功裏に精製し、結晶化試験に入った。 結晶化は、以前にFRを解凍することによって開始されましたozenタンパク質。結晶化は16で気候制御室で行われた℃のシッティングドロップ蒸気拡散（ 図7）のために特別に設計されたプレート（エメラルドバイオ）を使用。最初のスクリーニングは、4つのスパースマトリックススクリーニングを行った。JCSG +、パクト、ウィザードフル、および拡張ニューマン戦略に続くCryoFull（エメラルドバイオ）、。タンパク質溶液の0.4μlを、次に、96ウェルコンパクトジュニア結晶プレート（エメラルドバイオ社製）を用いて、対応するリザーバからcrystallantの0.4液（またはリザーバー溶液）と混合した。そのうち9 14精製試料の回折研究（ 図8）に適した結晶を得た。社内回折データセットはオスミウムバリマックスHF光学系とサターン944 + CCD検出器を備えたリガクsuperbrightのFR-E +回転陽極X線発生装置を用いてCuのKα波長で結晶9構築物5（ 図9に回収した）。各データセットは、XDS / XSCALE 4で処理した&lt;<html> SUP /&gt;、最終解像度にスケーリング。分子置換により構造を解決するための試みがCCP4スイート7からフェーザー 5を用いて行った。最終モデルはREFMAC 7の洗練とオオバン 11と手動再構築後に得られた。構造はMolProbity 9とジオメトリとフィットネスのために評価し、修正されました。PB2サブユニットの4構造の合計が決定されます（ 図10）、PDBに堆積した。 図11は MTPPパイプラインの各段階での全体的な結果を示しています。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> 図1。エメラルドバイオでマルチターゲット並列処理SSGCID遺伝子ツー構造経路の概要。 コンテンツ &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot;常に &quot;&gt; <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> 図2。アラインメントビューアとプロテイン遺伝子Composerソフトウェアの設計モジュールを構築します。アミノ酸ベースでは、ターゲットの構築緑色で示されています（中央のウィンドウ）と代替構文の構造誘導トランケーションは、金（下のウィンドウ）に表示されます。複数のインフルエンザウイルスのPB2配列のアラインメントは、配列および二次構造要素に比べて表示されますPDBID 3CW4からC末端ドメインである。ドメイン構造と二次構造要素の知識は、N末端 ​​短縮が所望のアミノ酸残基を右クリックすることで、遺伝子作曲·デザイン·モジュール内で選択することができます。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 図3a。 PIPEクローニングは、合成遺伝子挿入（オレンジ）がインサートPCR材料を生成するように前方に設計された（赤オレンジ色の線）および逆方向（オレンジ青線）プライマーにより増幅される前記示されている。発現ベクターを逆（赤-黒線で増幅される）、前方（ブルーブラックライン）プライマーベクトルPCR材を生成する。末端配列のiPCRを製品はVPCR製品の末端配列（iPCRをの赤iPCRをVPCRの青の赤を補完VPCRの青を補完）に相補的である。これはiPCRをとVPCR製品はホストBL21（DE3）化学的にコンピに転換によって複製されたプラスミドを形成するためにアニールすることができます大腸菌細胞 。 <img alt="図3b" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> 図3b。 iPCRを生産のアガロースゲル分析<html>成功iPCRを製品は堅牢なバンドで表現されながら、PB2サブユニットからTS。iPCRを障害が、かすかまたはべたつくバンドとして見られるかもしれない。 iPCRを製品の品質は、一般に、クローニングの成功と相関させることができる。分子量マーカーはキロダルトンである。図は、レイモンドら、2011年12から再生される。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> 図4。対象の遺伝子工学的工程PB2タンパク質は遺伝子Composerソフトウェアを用いて行った。操作された核酸配列は、ターゲットごとに確立された後、6-7代替タンパク質構築物は、それぞれのために設計された。遺伝子の設計およびクローニングの初期段階で、マルチターゲット並列処理はEの可溶性タンパク質を生産し実行可能な目標であった14そのうち34コンストラクトをもたらし大腸菌 。 <html>再5 &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; 図5。堅牢なタンパク質発現（25.76 kDaで予想されるサイズ）、（レーン7）溶出されたタンパク質から6×彼-SMTタグの切断約50％の可溶性（レーン4）および約50％を示した大規模な発酵の代表的なSDS-PAGE分析。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> 図6。ポリメラーゼPB2サブユニットの三構築物のためにSDS-PAGEの結果レーン1、分子量マーカー（kDaの左側に標識された）;レーン2、図6、10、ニッケル1カラムからのプールされたタンパク質、レーン3,7、そして11、ニッケル2から切断された緩衝液中のタンパク質のフロースルー、レーン4,8、および12、ニッケル2からバッファBで6倍彼-SMTタグを除去した。 d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; 図7。シッティングドロップ法による蒸気拡散の概略。シッティングドロップ法タンパク質結晶化のためには、蒸気拡散に該当。この方法は、高濃度で同様の条件を含む大規模な貯水池と平衡するタンパク質と沈殿剤の精製されたサンプルを必要とする。水はタンパク質試料及び振替からリザーバーに気化したように、沈殿剤濃度は、タンパク質結晶化のための最適なレベルに増加します。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> 図8。インフルエンザウイルス株に由来するポリメラーゼPB2サブユニットのタンパク質結晶。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> 図9。からポリメラーゼPB2サブユニットのX線回折像インフルエンザウイルスの菌株。 <img alt="図10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> 図10。 4 PB2の構造の結晶学的非対称単位中の分子のリボン図。対応するPDBコードを持つ虹のパターンで色の二次構造（A）3K2V（A/Yokohama/2017/2003/H3N2）（b）の 3KHW（/メキシコ/ InDRE4487/2009/H1N1）（c）は3KC6（A/Vietnam/1203/2004/H5N1）（d）の 3L56（A/Vietnam/1203/2004/H5N1）。 <img alt="図11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> 図11。記載されている方法によってインフルエンザPB2ターゲットに対する結果分析。structur電子決定パイプラインは5つのステップで説明します。クローニング、溶解、精製、結晶化や構造決定を。

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Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

構造に基づいたドラッグデザインは、薬物開発において重要な役割を果たしている。並行して複数のターゲットを追求すると、大幅にリード発見のための成功の可能性が高くなります。次の記事では、感染症のためにシアトル構造ゲノム科学センターでは、PB2インフルエンザサブユニットの遺伝子対構造決定のためのマルチターゲットアプローチを利用してどのように強調しています。

インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

インフルエンザAウイルス核を持つマウスMx1のタンパク質の共免疫沈降

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

豚からのインフルエンザAウイルスの検出および単離のための鼻ワイプ

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

蛍光ベースのノイラミニダーゼ阻害アッセイ抗ウイルスのノイラミニダーゼ阻害剤クラスにインフルエンザウイルスの感受性を評価します

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...