Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke alle medlemmer av SSGCID konsortiet. Oppnåelse av SSGCID mål er gjort mulig av den enorme innsatsen til alle teammedlemmene på Emerald Bio. Denne forskningen ble finansiert under Federal kontrakt nummer HHSN272200700057C fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, National Institutes of Health og Department of Health and Human Services.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

Forfatterne er ansatte i Emerald Bio, Inc.

Multi-Target Parallel Processing Struktur-basert drug design spiller en viktig rolle i medisiner. Den SSGCID er opptatt av å gi det vitenskapelige miljøet med tre-dimensjon protein strukturer fra NIAID kategorien AC patogener. Å gjøre en slik strukturell informasjon allment tilgjengelig til slutt vil tjene til å akselerere struktur-basert drug design. Den første kritiske trinn i MTPP tilnærming er konstruere design. Flere konstruksjoner av hvert mål protein øker sannsynligheten for vellykket struktur besluttsomhet og øker behandlingstid. Det er uunngåelig at noen protein konstruerer feiler under stadier av rørledningen. Implementere PIPE kloning metoden støtter MTPP metoden ved at den generasjonen av mange setninger i 96-brønners format uten arbeidsintensive rensing trinn. Sammenkobling PIPE kloning med evnen til å analysere protein uttrykk i det samme 96-brønnen format (Caliper LabChip 90) påskynder ytterligere den totale flyt. Sammenkoblingen av disse metodene gir mulighet for rask identifikasjon av konstruksjoner som produserer løselig protein som sikrer suksess for storskala protein produksjon og rensing. Et viktig aspekt for å lykkes i den MTPP høy gjennomstrømming er Protein Maker (US Patent No 6.818.060, Emerald Bio) instrument. Protein Maker er en 24-kanals parallell væske-kromatografi system utviklet spesielt for å øke effektiviteten av high-throughput protein produksjon og relaterte strukturelle genomisk rørledning forskning. Ved hjelp av den tidligere beskrevne protokoll for Protein Maker, fordelene er tydelig i forhold til en enkelt linje FPLC-system. En enkelt person kan rense opp til 48 mål i parallell i løpet av en åtte timers periode. I kontrast, kan en enkelt person ved hjelp av en enkelt linje FPLC systemet bare rense maksimalt fire mål innenfor samme tidsramme. De høye nivåene av renhet på hvert måloppnådd med Protein Maker er en kritisk faktor i den senere suksess med voksende protein krystaller for struktur-analyse. Begrensninger og feilsøking Løse tredimensjonale strukturer ved røntgenkrystallografi er en flertrinns forsøk med en rekke utfordringer, hvorav den ene er den manglende evne til å oppnå store mengder av løselig målprotein. En strategi som kan implementeres for å overvinne løseligheten problem er bruken av en alternativ ekspresjonsvert som E. coli-celler er ikke i stand til å utføre flere viktige eukaryotiske posttranslasjonelle modifikasjoner. Ekspresjon i forskjellige gjær, insekt-og pattedyr-cellelinjer som er i stand til å utføre disse post-translasjonelle modifikasjoner er ofte et egnet alternativ. Målproteiner er noen ganger uttrykt men helt uløselig i standard lysis forhold. Protein Maker kan være en verdifull ressurs for rask testing av alternative cellelysis forholdsom beskrevet i Smith et al. 2011 13. Denne strategien er ofte nødvendig for å holde målene beveger seg gjennom rørledningen. I noen strukturelle genomikk rørledning, kan standardiserte protokoller ikke være egnet for hvert mål som kommer gjennom rørledningen og mål kan trenge individuell optimalisering. For eksempel har vi valgt å bruke 20% etylenglykol for hver cryoprotectant. I saker som denne tilstanden ikke er egnet, kan alternative cryoprotectants eller konsentrasjoner må testes. På grunn av den unike natur av hver enkelt protein mål, er det hastighetsbegrensende og uforutsigbare trinn for å bestemme en struktur krystallisering. De MTPP rørledning oppveier ofte lav suksessrate på protein krystallisering med optimalisering fra de innledende sparsom matrise skjermer. Hver første krystall rammet fra kommersielt tilgjengelige sparsom matrise skjermer er ytterligere optimalisert med en E-Screen Builder (Emerald Bio). Optimalisering skjermen er utformet around tilstand av den første krystall treffet, forandre konsentrasjonene av de buffere, salter og additiver. Vellykket optimalisering skjermene gi krystaller egnet for diffraksjon studier og struktur besluttsomhet. Den strukturelle genomikk programmet lagt frem av National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) gir støtte til Emerald Bio og tre andre Pacific Northwest institusjoner som til sammen er det SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, University of Washington og Pacific Northwest National Laboratory) . Hvert medlem av konsortiet ble valgt for sin kompetanse i å anvende state-of-the-art teknologi som kreves for å oppnå målene i NIAID strukturelle genomikk program. Til dags dato har SSGCID avsatt 461 strukturer i PDB ranking det som den syvende største bidragsyteren i verden, og i 2011, den mest produktive. Protokoller og metoder i SSGCID er utstyrt med den hensikt å gagnevitenskapelige samfunnet og vedlikeholdende forskning av smittsomme sykdommer.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

Pandemi utbrudd av svært virulente influensa stammer kan føre til omfattende sykelighet og dødelighet i menneskelige befolkninger over hele verden. I USA alene, er et gjennomsnitt på 41 400 dødsfall og 1,86 millioner sykehusinnleggelser forårsaket av influensavirus infeksjon hvert år en. Punktmutasjoner i polymerase basisk protein 2 subenhet (PB2) har vært knyttet til tilpasning av den virale infeksjon hos mennesker 2. Funn fra slike studier har avdekket den biologiske betydningen av PB2 som en virulens faktor, og dermed fremheve sitt potensial som en antiviral medikament målet. Den strukturelle genomikk programmet lagt frem av National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) gir støtte til Emerald Bio og tre andre Pacific Northwest institusjoner som til sammen utgjør Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). Den SSGCID er opptatt av å gi det vitenskapelige miljøet med three-dimensjonale protein strukturer av NIAID kategorien AC patogener. Å gjøre en slik strukturell informasjon tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet tjener til å akselerere struktur-basert drug design. Struktur-basert drug design spiller en viktig rolle i utvikling av legemidler. Forfølge flere mål parallelt i stor grad øker sjansen for suksess for ny leder oppdagelsen ved å målrette en sti eller et helt protein familien. Emerald Bio har utviklet en høy gjennomstrømning, multi-target parallell prosessering rørledning (MTPP) for gen-til-struktur vilje til å støtte konsortiet. Her beskriver vi protokollene som brukes for å bestemme strukturen av PB2 subenheten fra fire forskjellige influensa A stammer.

De følgende resultater illustrerer de forventede resultatene av den beskrevne protokoll, og i tilfelle av PB2, de observerte resultater. Ved hjelp Gene Redigering, fem full-lengde target aminosyresekvenser av influensavirus polymerase subenhet PB2 ble konstruert (figur 2). De Pb2 sekvenser ble tilbake oversatt og utsatt for mange tekniske trinn 3, noe som resulterer i kodon-sekvenser harmoniserte optimalisert for ekspresjon i E. coli. Fra de IPCR produkter (Figur 3b), totalt trettifire konstruerer ble klonet inn i en modifisert pET28 vektor system 10 med en N-terminal 6x Hans-SMT fusjon tag bruke PIPE kloning 3 som vist i figur 3a. En oppsummering av kloning arbeidsflyten vist i figur 4.. Etter vellykket kloning, ble mikro-skala protein uttrykk for hver konstruksjon testet i BL21 (DE3) E.coli-celler. Cellene ble dyrket i TB medium supplert med Novagen Overnight Express ett medium (i henhold til produsentens protokoll) i 48 timer ved 20 ° C i en rysteinkubator sett på 220 rpm. Etter vekst, ble cellene høstet og testet for løselig protein uttrykk ved hjelp av kapillære electrophoreses med en Caliper LabChip 90. Fjorten av de trettifire Pb2 konstruerer førte til løselig mål protein og gikk storstilt gjæring. Storstilt kulturer av hver konstruksjon ble dyrket i TB medium supplert med Novagen sin Overnight Express ett medium i henhold til produsentens protokoll. Etter vekst ble celler høstet via sentrifugering og lagret ved -80 ° C. Storskala proteinekspresjon av hver kultur ble bekreftet via SDS-PAGE-analyse (figur 5) før fortsetter med storskala-rensing. Protein Maker ble brukt til å gjennomføre parallelle rensing av de fjorten Pb2 konstruksjoner. De avklart lysater av all fjorten konstrukter ble kjørt gjennom en nikkel-chelat kolonne. Etter å bestemme hvilke fraksjoner inneholdt målprotein ved SDS-PAGE, ble de tilsvarende fraksjoner ble samlet for hver prøve og konsentrasjonen av hver ble bestemt ved en A 280 lesing. Fjernelse av 6x His-SMT tag ble utført ved tilsetning av ULP1 etterfulgt av dialyse over natten og en andre nikkel kolonne. Bekreftelse av His-SMT tag fjerning ble utført ved hjelp av SDS-PAGE (figur 6), og hver prøve ble konsentrert med en 10 kDa Amicon ultra sentrifugerør. Etter konsentrasjon ved anvendelse av Amicon ultra-sentrifugerør, ble hver prøve kjørt over en dimensjonering kolonne for å oppnå krystallografisk renhet. En andre konsentrasjon ble utført for å øke proteinkonsentrasjonen til et nivå som er nødvendig for krystallisering. Alle fjorten konstruerer ble vellykket renset og inngått krystallisering prøvelser. Krystallisering ble innledet ved tining den tidligere frozen protein. Krystallisering ble utført i et klima kontrollert rom ved 16 ° C med spesielt utformede plater (Emerald Bio) for sittende dråpe dampdiffusjon (figur 7). Innledende screening ble utført med fire sparsom matrise-skjermer; JCSG +, Pact, Wizard Full og CryoFull (Emerald Bio), etter en utvidet Newman strategi. 0,4 mL av protein oppløsning ble deretter blandet med 0,4 pl av crystallant (eller reservoar-løsning) fra den tilsvarende reservoar ved anvendelse av 96-brønn Kompakte Jr krystallisasjons plater (Emerald Bio). Av de fjorten rensede prøvene ni stykker ga krystaller egnete for diffraksjons-studier (figur 8). En in-house diffraksjon datasett ble samlet på fem av de ni konstruerer krystallisert på Cu Ka bølgelengde med en Rigaku SuperBright FR-E + roterende anode X-ray generator utstyrt med Osmic VariMAX HF-optikk og en Saturn 944 + CCD detektor (figur 9 ). Hvert datasett ble behandlet med XDS / XScale 4 &lt;<html> / Sup&gt; og skalert til endelig vedtak. Forsøk på å løse strukturene ved molekylær erstatning ble utført med Phaser 5 fra CCP4 suite 7. De endelige modellene ble innhentet etter raffinement i REFMAC 7 og manuell ombygging med Kvakk 11. Strukturene ble vurdert og korrigert for geometri og fitness med MolProbity 9. Totalt fire strukturer i PB2 subenheten ble bestemt (Figur 10) og deponert i PDB. Figur 11 illustrerer den samlede resultat ved hvert stadium i MTPP rørledningen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> Figur 1. Oversikt over SSGCID gen-til-struktur vei for Multi-target parallell behandling på Emerald Bio. innhold &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> Figur 2. Alignment Viewer og Protein Konstruer Design Module i Gene Composer. Amino-syre base konstruere av målet vises i grønt (midten vindu) og struktur guidede trunkeringer av alternative konstruksjoner er vist i gull (nederste vinduet). En justering av flere influensa viral Pb2 sekvenser er vist i forhold til sekvensen og sekundære strukturelementer av C-terminal domene fra PDBID 3CW4. Kunnskap om domenet struktur og sekundære strukturelementer gjør N-terminal trunkeringer å bli valgt innenfor Gene Komponist Design Module ved å høyreklikke på ønsket aminosyreresten. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . Figur 3a. PIPE kloning er illustrert hvor syntetisk gen innsats (orange) er forsterket av designet fremover (rød-oransje linjer) og revers (orange-blå linjer) primere å generere sette PCR materiale. Ekspressjonsvektor er forsterket med revers (rød-svarte linjer ) og fremover (blå-svarte linjer) primere å generere vektor PCR materiale. Terminalen sekvenser IPCR produkter er komplementære til de terminale sekvenser av vPCR produkter (rød av IPCR utfyller røde av vPCR og blå IPCR utfyller blå vPCR). Dette gjør at IPCR og vPCR produkter til anneal å danne plasmider som er kopiert på transformasjon til verten BL21 (DE3) kjemisk kompetente E. coli-celler. <img alt="Figur 3B" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> Figur 3B. Agarose gel analyse av IPCR produksjon<html> ts fra PB2 subenheten. IPCR feil kan bli sett på som svake eller smeary band, mens vellykkede IPCR produkter er representert ved robuste band. IPCR produktkvalitet kan vanligvis være korrelert med kloning suksess. Molekylvektmarkører er i kiloDaltons. Figuren er gjengitt fra Raymond et al., 2011 12.. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> Figur 4. Gene tekniske trinn på target Pb2 proteiner ble utført med Gene Composer. Etter konstruert nukleinsyre sekvens ble etablert for hvert mål, ble 6-7 alternative proteinkilder konstruerer designet for hver. Multi-target parallell behandling i de innledende trinnene av genet utforming og kloning resulterte i 34 konstruksjoner, hvorav 14 var levedyktige mål som produserte oppløselige proteiner i E. coli. <html> re 5 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; Figur 5. Representant SDS-PAGE analyse av storskala fermentering viser robust protein uttrykk (forventet størrelse på 25,76 kDa), omtrent 50% løselig (lane 4) og ca 50% spalting av 6x Hans-SMT tag fra eluerte protein (lane 7). <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> Figur 6. SDS-PAGE resultater for tre konstruksjoner av polymerase PB2 subenhet en Lane, molekylær-vekt markører (merket til venstre i kDa),. Baner 2, 6 og 10, samlet protein fra Nickel en kolonne, baner 3, 7 og 11, gjennomstrømning av kløyvde protein i buffer A fra Nickel 2, baner 4, 8 og 12, fjerning av 6x Hans-SMT tag i buffer B fra Nickel to. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; Figur 7. En skjematisk av dampdiffusjon av den sittende slipp-metoden. Den sittende slipp-metoden for protein krystallisering faller under kategorien dampdiffusjon. Denne metoden innebærer en renset prøve av proteinet og fellingsmidlet til likevekt med et større reservoar inneholdende lignende tilstander i en høyere konsentrasjon. Når vann fordamper fra proteinet og overfører prøven til reservoaret, øker konsentrasjonen fellingsmidlet til et optimalt nivå for protein krystallisering. <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> Figur 8. Protein krystall av polymerase PB2 underenhet fra en stamme av influensavirus. <img alt="Figur 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> Figur 9. Røntgendiffraksjon bilde av polymerase PB2 subenheten fra enstamme av influensavirus. <img alt="Figur 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> Figur 10. Ribbon diagrammer av molekylene i krystallografisk asymmetrisk enhet av fire PB2 strukturer. Sekundære konstruksjoner farget i regnbuens mønster med tilsvarende PDB koder. (A) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / Mexico / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="Figur 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> Figur 11. Utfallet analyse for influensa Pb2 mål av metodene beskrevet. Den Struktureringe bestemmelse rørledning er illustrert i fem trinn: Kloning, løselighet, rensing, krystallisering og strukturbestemmelse.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Struktur-basert drug design spiller en viktig rolle i utvikling av legemidler. Forfølge flere mål parallelt i stor grad øker sjansen for suksess for bly oppdagelse. Den følgende artikkelen belyser hvordan Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease benytter en multi-target tilnærming for gen-til-struktur fastsettelse av PB2 influensa A underenhet.

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-til-struktur Fastsettelse av Influensa Polymerase PB2 underenhet

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Method for influensavirus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinity Rensing av influensavirus ribonucleoprotein Komplekser fra Chromatin av infiserte celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administrering av rekombinant influensavaksiner i Chimerisk musemodeller for å studere slimhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation av musen Mx1 Protein med influensa A virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes for influensa A virus Detection og isolering mot svine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

En miniatyrisert Glycan microarray analyse for å vurdere grådighet og spesifisitet av influensa A virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Demontering av influensa A virus kapsider ved gradientsentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescens-baserte Neuraminidase inhiberingsanalyse for å vurdere i hvilken grad influensavirus til neuraminidase Inhibitor Class of Antivirale

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...