Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do consórcio SSGCID. Consecução dos objetivos da SSGCID é possível graças as enormes esforços de todos os membros da equipe em Emerald Bio. Esta pesquisa foi financiada no âmbito do contrato Federal n º HHSN272200700057C do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, dos Institutos Nacionais de Saúde e do Departamento de Saúde e Serviços Humanos.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

Os autores são funcionários da Emerald Bio, Inc.

Multi-Alvo Processamento Paralelo Concepção de fármacos com base Estrutura desempenha um papel importante na descoberta de drogas. O SSGCID é dedicado a fornecer a comunidade científica com estruturas de proteínas em três dimensões a partir de NIAID categoria patógenos AC. Fazendo essa informação estrutural amplamente disponível acabará por servir para acelerar o desenho de drogas baseado em estrutura. O primeiro passo crítico da abordagem MTPP é o projeto da construção. Várias construções de cada proteína alvo aumenta a probabilidade de a determinação da estrutura e aumenta o retorno bem sucedido. É inevitável que algumas construções de proteína irá falhar durante os estágios do pipeline. Aplicação do método de clonagem TUBO suporta o método MTPP, permitindo a geração de muitas construções em formato de 96 poços, sem passos de purificação de trabalho intensivo. Emparelhamento clonagem tubo com a capacidade de analisar a expressão de proteína com o mesmo formato de 96 poços (Caliper LabChip 90) agiliza ainda mais o fluxo total. O emparelhamento destes métodos permite a rápida identificação de construções que produzem a proteína solúvel, que garante o sucesso da produção de proteína em larga escala e purificação. Um aspecto essencial para o sucesso da MTPP alto rendimento é o fabricante de proteínas (Patente dos EUA No. 6.818.060, Emerald Bio) instrumento. A proteína Maker é um canal paralelo 24 sistema de cromatografia líquida desenvolvida especificamente para aumentar a eficiência da produção de proteína de alto rendimento e as aplicações de investigação gasoduto relacionados estruturais genômicas. Utilizando o protocolo anteriormente descrito para a proteína de chá, as vantagens são evidentes, em comparação com um único sistema de FPLC linha. Uma única pessoa pode purificar até 48 alvos em paralelo dentro de um período de oito horas. Em contraste, uma única pessoa que utiliza um único sistema de FPLC linha só pode purificar a um máximo de quatro alvos dentro do mesmo período de tempo. Os altos níveis de pureza para cada alvoobtida com a proteína Maker são um factor crítico no sucesso posterior do crescimento de cristais de proteínas para análise da estrutura. Limitações e problemas Solução de estruturas tridimensionais por cristalografia de raios-x é um esforço de multi-estágios com vários desafios, uma das quais é a incapacidade de obter grandes quantidades de proteína alvo solúvel. Uma estratégia que possa ser aplicado para ultrapassar o problema de solubilidade é o uso de um hospedeiro de expressão alternativo como E. células coli são incapazes de realizar vários importantes eucarióticas modificações pós-traducionais. Expressão em várias leveduras, linhas celulares de insecto e de mamífero que são capazes de realizar estas modificações pós-traducionais são frequentemente uma alternativa adequada. Proteínas alvo são por vezes expressos mas completamente insolúvel nas condições padrão de lise. A proteína Maker pode ser um recurso valioso para o teste rápido de condições de lise celular alternativastal como descrito em Smith et ai. 2011 13. Esta estratégia é muitas vezes necessário para manter alvos em movimento através do pipeline. Em qualquer gasoduto genômica estrutural, protocolos padronizados pode não ser adequado para todos os alvos que vem através do gasoduto e as metas podem precisar de otimização individual. Por exemplo, optou-se por utilizar 20% de etileno glicol para cada crioprotetor. No caso de esta condição não é adequado, os crioprotectores ou concentrações alternativas podem precisar de ser testado. Devido à natureza única de cada proteína alvo individual, a taxa de limitação e imprevisível passo na determinação de uma estrutura é a cristalização. Os deslocamentos gasoduto MTPP o comumente baixa taxa de sucesso de cristalização de proteínas com a otimização das telas iniciais matriz esparsas. Cada cristal inicial bater comercialmente disponíveis a partir de telas de matriz esparsa é ainda mais otimizado com um Construtor de E-Screen (Emerald Bio). A tela de otimização é projetado around o estado do cristal de acerto inicial, alterando a concentração dos sais, tampões e outros aditivos. Telas de otimização de sucesso produzir cristais adequados para estudos de difração e determinação estrutura. O programa de genômica estrutural estendeu pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) oferece financiamento para Emerald Bio e outras três instituições Pacific Northwest que, juntos, são a SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, da Universidade de Washington e Pacific Northwest National Laboratory) . Cada membro do consórcio foi escolhido por sua experiência em aplicação de tecnologias state-of-the-art necessários para realizar os objetivos do programa de genômica estrutural NIAID. Até à data, SSGCID tenha depositado 461 estruturas para o ranking PDB como o sétimo maior contribuinte no mundo e, em 2011, o mais produtivo. Os protocolos e metodologias da SSGCID são fornecidos com a intenção de beneficiar ocomunidade científica e perpetuar a pesquisa de doenças infecciosas.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

Surtos de pandemia de cepas de influenza altamente virulentas podem causar morbidade e mortalidade generalizada nas populações humanas em todo o mundo. Só nos Estados Unidos, uma média de 41.400 mortes e hospitalizações 1.860.000 são causadas por infecção pelo vírus da gripe em cada ano 1. As mutações pontuais na polimerase subunidade da proteína básica 2 (PB2) têm sido associados à adaptação da infecção virai em seres humanos 2. Os resultados de tais estudos revelaram a importância biológica da PB2 como um fator de virulência, destacando, assim, o seu potencial como um alvo da droga antiviral. O programa de genômica estrutural estendeu pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) oferece financiamento para Emerald Bio e outras três instituições Pacific Northwest que, juntos, compõem o Seattle Center Structural Genomics para Doenças Infecciosas (SSGCID). O SSGCID é dedicado a fornecer à comunidade científica threestruturas de proteínas e-dimensionais de NIAID categoria patógenos AC. Fazendo essa informação estrutural disponível para a comunidade científica serve para acelerar o desenho de drogas baseado em estrutura. Concepção de fármacos com base Estrutura desempenha um papel importante no desenvolvimento de medicamentos. Prosseguindo alvos múltiplos em paralelo aumenta a chance de sucesso para a nova descoberta de liderança, visando um caminho ou uma família de proteínas inteiro. Emerald Bio desenvolveu um pipeline de processamento paralelo de alto rendimento, multi-target (MTPP) para gene-to-estrutura de determinação de apoiar o consórcio. Descrevemos aqui os protocolos usados ​​para determinar a estrutura da subunidade PB2 de quatro estirpes de gripe A diferente.

Os resultados seguintes ilustram os resultados esperados se o protocolo descrito, e, no caso de PB2, os resultados observados. Usando Composer Gene, cinco seqüências de aminoácidos alvo full-length do vírus influenza subunidade da polimerase PB2 foram concebidos (Figura 2). As seqüências foram PB2 volta traduzido e submetido a várias etapas de engenharia 3, resultando em seqüências harmonizadas códons otimizados para expressão em E. coli a partir dos produtos. IPCR (Figura 3b), um total de trinta e quatro constructos foram clonados com sucesso num sistema de vector pET28 modificado 10 com um N-terminal de 6x His-tag Smt fusão usando clonagem TUBO 3 como mostrado na Figura 3a. Um resumo do fluxo de trabalho de clonagem é apresentado na Figura 4. Após a clonagem bem sucedida, a expressão de proteínas em micro-escala de cada construção foi testada em células BL21 (DE3) de E.células de E. coli. As células foram cultivadas em meio TB suplementado com Novagen noite expresso um meio (de acordo com o protocolo do fabricante) durante 48 horas a 20 ° C numa incubadora com agitação conjunto a 220 rpm. Após crescimento, as células foram colhidas e testadas quanto à expressão da proteína solúvel usando eletroforese capilar com um compasso de calibre 90 LabChip. Catorze dos trinta e quatro PB2 construções levaram à proteína alvo solúvel e entrou fermentação em larga escala. Culturas em larga escala de cada construção foram cultivadas em meio TB suplementado com 1 noite expresso meio de Novagen de acordo com o protocolo do fabricante. Após crescimento, as células foram colhidas através de centrifugação e armazenadas a -80 ° C. A expressão da proteína em larga escala de cada cultura foi confirmada através de análise de SDS-PAGE (Figura 5) antes de continuar com a purificação em grande escala. A proteína Maker foi usado para realizar a purificação paralelo dos catorze construções PB2. Os lisados ​​esclarecidas de all catorze construções foram executadas através de uma coluna de níquel-quelato. Depois de determinar que fracções continham proteína alvo por SDS-PAGE, as fracções correspondentes foram reunidas para cada amostra e a concentração de cada foi determinada por uma leitura de A 280. A remoção da etiqueta de His-Smt 6x foi realizado pela adição de ULP1 seguido de diálise durante a noite e uma segunda coluna de níquel. Confirmação da remoção da etiqueta de His-Smt foi realizada por SDS-PAGE (Figura 6), e cada amostra foi concentrada com um tubo de centrífuga kDa Amicon Ultra-10. Após a concentração, utilizando os tubos de centrífuga Ultra Amicon, cada amostra foi corrido numa coluna de dimensionamento de atingir pureza cristalográfica. Uma segunda concentração foi efectuada para aumentar a concentração de proteína a um nível necessário para a cristalização. Todos os quatorze construções foram purificados e entraram em ensaios de cristalização com sucesso. A cristalização foi iniciada por descongelação do anteriormente frproteína ozen. A cristalização foi realizado numa sala de clima controlado a 16 ° C, com placas especialmente concebidos (Emerald Bio) para estar gota de difusão de vapor (Figura 7). Triagem inicial foi realizado com quatro telas de matriz esparsa; JCSG +, Pacto, Assistente completa e CryoFull (Emerald Bio), seguindo uma estratégia de Newman estendida. 0,4 ul de solução de proteína foi então misturada com 0,4 ml de crystallant (ou solução de reservatório) do reservatório correspondente utilizando placas de cristalização de 96 poços Jr compactas (Emerald Biológicos). Dos catorze amostras purificadas nove deles produziram cristais adequados para estudos de di fracção (Figura 8). Uma in-house difração conjunto de dados foi coletado em cinco das nove construções cristalizadas em Cu Ka comprimento de onda usando um Rigaku SuperBright FR-E + rotativa-ânodo gerador de raios X equipado com Osmic VariMAX HF óptica e um Saturn 944 + detector CCD (Figura 9 ). Cada conjunto de dados foi processada com XDS / XSCALE 4 &lt;<html> / Sup&gt; e escalado para uma resolução final. As tentativas para resolver as estruturas por substituição molecular foram realizadas com 5 Phaser do pacote CCP4 7. Os modelos finais foram obtidos após refinamento na REFMAC 7 e reconstrução manual com Galeirão 11. As estruturas foram avaliadas e corrigida para a geometria e aptidão com MolProbity 9. Um total de quatro estruturas da subunidade PB2 foram determinados (Figura 10) e depositado no PDB. Figura 11 ilustra o resultado total em cada fase na tubagem MTPP. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> Figura 1. Visão geral da via gene-to-estrutura SSGCID para processamento paralelo Multi-alvo em Emerald Bio. conteúdo &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> Figura 2. Visualizador de alinhamento e Proteína Construir Módulo de Design, em software Composer Gene. Construção do destino da base de aminoácidos é mostrada em verde (janela do meio) ea estrutura truncations guiadas de construções alternativas são mostradas em ouro (janela inferior). Um alinhamento de múltiplas sequências de gripe viral PB2 é mostrado em relação à seqüência e elementos de estrutura secundária do domínio C-terminal a partir 3CW4 PDBID. O conhecimento da estrutura de domínio e elementos de estrutura secundária permite truncations N-terminal a ser escolhido dentro do Módulo Projeto Composer Gene clicando no resíduo de aminoácido desejado. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . Figura 3A. Clonagem tubo é ilustrado em que a inserção de gene sintético (laranja) é amplificada pela projetado para frente (linhas vermelho-alaranjado) e primers reversos (linhas laranja-azul) para gerar inserir material de PCR. Vector de expressão é amplificado com linhas inversa (rubro-negras ) e para frente (linhas azul e preto), primers para gerar material de vetor PCR. As sequências de produtos IPCR terminais são complementares às seqüências terminais de produtos VPCR (vermelho de IPCR complementa vermelho de VPCR e azul de IPCR complementa azul VPCR). Isto permite que os produtos de IPCR e VPCR recozer para formar os plasmídeos que são replicados a transformação em hospedeiro BL21 (DE3) de E. quimicamente competente células de E. coli. <img alt="Figura 3b" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> Figura 3B. Análise em gel de agarose de IPCR produção<html> ts da subunidade PB2. IPCR falhas podem ser vistos como bandas ténues ou manchada, enquanto os produtos de IPCR bem sucedidas são representadas por bandas robustos. a qualidade do produto pode geralmente ser IPCR correlacionada com sucesso a clonagem. Marcadores de peso molecular são em kDa. A figura é reproduzida a partir de Raymond et al., 2011 12. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> Figura 4. Gene passos de engenharia de proteínas PB2 alvo foram realizadas utilizando o software Compositor Gene. Depois foi estabelecida a sequência de ácido nucleico de engenharia para cada destino, 6-7 construções alternativas de proteínas foram desenhados para cada um. Processamento paralelo multi-alvo nas etapas iniciais do projeto gene e clonagem resultou em 34 construções, das quais 14 eram alvos viáveis ​​que produzem proteínas solúveis em E. coli. <html> re 5 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Representativas de análise de SDS-PAGE de fermentação em grande escala mostrando a expressão da proteína robusta (tamanho esperado de 25,76 kDa), cerca de 50% solúvel em água (pista 4) e cerca de 50% de clivagem da etiqueta 6x His-Smt de proteína eluida (pista 7). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> Figura 6. Resultados de SDS-PAGE de três construções da polimerase subunidade PB2 pista 1, os marcadores de peso molecular (rotuladas à esquerda em kDa),. Pistas 2, 6 e 10, proteínas agrupados a partir de uma coluna de níquel; faixas 3, 7 e 11, fluxo através da proteína clivada em tampão A a partir de 2 de níquel; pistas 4, 8 e 12, a remoção de etiqueta 6x His-Smt em tampão B a partir de 2 de níquel. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Um esquema de difusão de vapor pelo método da gota sentada. Método queda sentado por cristalização de proteínas cai sob a categoria de difusão de vapor. Este método baseia-se uma amostra purificada de proteína precipitante e equilibrar-se com um reservatório maior contendo condições semelhantes em uma concentração mais elevada. Como a água se vaporiza a partir da amostra de proteína e transfere para o reservatório, a concentração do precipitante aumenta para um nível óptimo para a cristalização de proteínas. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> Figura 8. A proteína cristalina de polimerase PB2 subunidade de uma estirpe do vírus da gripe. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> Figura 9. Imagem da polimerase a partir de uma subunidade de PB2 de difracção de raios-Xestirpe do vírus da gripe. <img alt="Figura 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> Figura 10. Fita diagramas das moléculas na unidade assimétrica cristalográfica de quatro estruturas. PB2 estruturas secundárias no padrão colorido arco-íris com códigos correspondentes. PDB (a) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / México / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="Figura 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> Figura 11. Análise de resultado para gripe PB2 alvos pelos métodos descritos. The structure determinação do gasoduto é ilustrada em cinco passos: clonagem, a solubilidade, a purificação, a cristalização e determinação de estrutura.

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Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Concepção de fármacos com base Estrutura desempenha um papel importante no desenvolvimento de medicamentos. Prosseguindo alvos múltiplos em paralelo aumenta a chance de sucesso para a descoberta de chumbo. O seguinte artigo destaca como o Seattle Center Structural Genomics para Doenças Infecciosas utiliza uma abordagem multi-alvo para determinação da influenza A subunidade PB2 gene-to-estrutura.

Abordagem de processamento paralelo multi-alvo para Gene-a-estrutura Determinação da polimerase da gripe PB2 Subunidade

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

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In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

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-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

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