Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить всех членов SSGCID консорциума. Достижение целей в SSGCID стало возможным благодаря огромным усилиям всех членов команды в Изумрудном Bio. Это исследование было профинансировано в соответствии с Федеральным HHSN272200700057C договору № от Национального института аллергии и инфекционных болезней, Национальные институты здравоохранения и Департамент здравоохранения и социальных служб.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

Авторы являются сотрудниками Emerald Bio, Inc

Многоцелевой Параллельная обработка Структура проектирования на основе наркотиков играет важную роль в лекарственных препаратах. SSGCID посвящен обеспечению научного сообщества с трехмерной структуры белка из NIAID категории патогенов переменного тока. Создание таких структурных широкого доступа к информации, в конечном счете служат для ускорения на основе структуры разработке лекарственных препаратов. Первым важным шагом подхода МТПП является конструкцией дизайна. Несколько конструкций каждой целевой белок увеличивает вероятность успешного определения структуры и увеличивает поворот. Это неизбежно, что некоторые белки конструкции не удастся во время этапа трубопровода. Реализация метода трубы клонирование поддерживает MTPP метод, позволяя генерации много конструкций в 96-луночном формате без трудоемких стадий очистки. Сопряжение PIPE клонирования с возможностью анализа экспрессии белков в том же 96-луночный формат (суппорт ЛабораторииЧип 90) далее ускоряет общий поток. Спаривание этих методов обеспечивает быструю идентификацию конструкций, которые производят растворимого белка, который обеспечивает успех крупномасштабного производства и очистки белков. Важным аспектом для успеха МТПП высокой пропускной представляет собой белок, чайник (патент США № 6818060, изумруд BIO) инструмента. Белки Maker представляет собой 24-канальный параллельный жидкостной хроматографии система, разработанная специально для повышения эффективности высокой пропускной производства белков и связанных с ними структурных геномных исследовательских задач трубопровода. С помощью описанных выше протоколом для белка чайник, преимущества очевидны по сравнению с одной системы FPLC линии. Один человек может очистить до 48 целей в пределах параллельной восемь часов. В отличие, один человек с помощью одной системы FPLC линия может только очищают не более четырех целей в те же сроки. Высокие уровни чистоты для каждой целевойдостигнуты с белком в данной программе являются критическим фактором в более поздних успех растущей белковых кристаллов для структурного анализа. Ограничения и устранение неисправностей Решение трехмерной структуры с помощью рентгеновской кристаллографии многоступенчатая усилий со многими проблемами, одной из которых является невозможность получения большого количества растворимого белка-мишени. Одна из стратегий, которые могут быть реализованы, чтобы преодолеть растворимость проблемы является использование альтернативного вида микроорганизмов, как E. кишечной клетки не способны выполнять несколько важных эукариотических пост-трансляционных модификаций. Выражение в различных дрожжей, насекомых и млекопитающих клеточных линий, которые способны выполнять эти посттрансляционных модификаций часто приемлемой альтернативой. Белки-мишени иногда выражаются, но полностью нерастворимые в стандартных условиях лизиса. Белки Maker может быть ценным ресурсом для быстрого тестирования альтернативных условиях лизиса клеток, как описано в Смит и др.. 2011 13. Эта стратегия часто необходимо держать целей, движущихся по трубопроводу. В любом структурной геномики трубопровода, стандартизированные протоколы не могут быть пригодны для каждой цели, которая поставляется по трубопроводу и задач может потребоваться отдельные оптимизации. Например, мы решили использовать 20% этиленгликоля для каждого криопротекторе. В случаях, когда это условие не подходит, альтернативные криопротекторы или концентраций возможно, должны быть проверены. Из-за уникального характера каждого отдельного целевой белок, ограничивающий скорость и непредсказуемым шагом в определении структуры кристаллизации. Смещения МТПП трубопровода обычно низкого успеха кристаллизации белков с оптимизацией от начальной редкие экраны матрицы. Каждый исходный кристалл ударил из коммерчески доступных экранов редкие матрицы дальнейшая оптимизация E-экран Builder (Emerald BIO). Оптимизация экран предназначен ARкруглый условие начального удара кристаллов, изменение концентрации буферов, солей и добавок. Успешная оптимизация экранов получить кристаллы, пригодные для дифракционных исследований и определения структуры. Программа структурной геномики выдвинутые Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) предоставляет финансирование Emerald Bio и три других Тихоокеанском Северо-Западе учреждений, которые вместе являются SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, Университета Вашингтона и Pacific Northwest National Laboratory) . Каждый член консорциума была выбрана за их опыт в применении государством в самых современных технологий, необходимых для достижения целей NIAID структурной геномики программы. На сегодняшний день SSGCID на хранение 461 структур в PDB рейтинге его как седьмой по величине вкладчиком в мире, и в 2011 году, наиболее продуктивным. Протоколы и методологии SSGCID снабжены намерением управлятьнаучного сообщества и увековечения исследования инфекционных заболеваний.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

Пандемия вспышки высоко вирулентных штаммов гриппа может привести к широкомасштабным заболеваемости и смертности в популяциях человека во всем мире. В одних только Соединенных Штатах, в среднем 41 400 смертей и госпитализаций 1860000 вызваны вирусной инфекцией гриппа каждый год 1. Точечные мутации в полимераза основного белка 2 субъединиц (PB2) были связаны с адаптацией вирусной инфекции в организме человека 2. Выводы из такого исследования показали, биологическое значение PB2 как фактор вирулентности, тем самым подчеркивая его потенциал в качестве противовирусного препарата целевой. Программа структурной геномики выдвинутые Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) предоставляет финансирование Emerald Bio и три других учреждений Тихоокеанского Северо-запада, которые вместе составляют Сиэтле структурной геномике центра инфекционных болезней (SSGCID). SSGCID посвящен обеспечению научного сообщества с Автошоуэлектронной мерной белковые структуры NIAID категории патогенов переменного тока. Создание таких структурных информацию доступной для научного сообщества служит для ускорения на основе структуры разработке лекарственных препаратов. Структура проектирования на основе наркотиков играет важную роль в разработке лекарственных препаратов. Занимаясь несколько целей параллельно значительно увеличивает шансы на успех нового открытия свинца, направляя путь или всей семьей белка. Emerald Bio разработала высокой пропускной способностью, Многоадресное параллельной конвейерной обработки (МТПП) для гена на элемент структуры решимость поддержать консорциума. Здесь мы описываем протоколы, используемые для определения структуры PB2 субъединицы из четырех различных штаммов гриппа А.

Следующие результаты иллюстрируют ожидаемые результаты описанного протокола, и в случае PB2, наблюдаемые результаты. Использование гена композитор, пять полнометражных целевой аминокислотной последовательности полимеразы гриппа PB2 субъединицы вируса были разработаны (рис. 2). PB2 последовательности обратной трансляции и подвергали многих шагов инженерной 3, в результате чего кодона последовательности согласованных оптимизированные для экспрессии в E. палочки. Из продуктов IPCR (рис. 3б), в общей сложности тридцать четыре конструкции были успешно клонировали в модифицированный вектор pET28 системы 10 с N-концевым 6х His-Smt тег сплав использованием труб клонирование 3, как показано на фиг.3а. Краткая информация о клонировании рабочий процесс представлен на рисунке 4. После успешного клонирования, микро-масштабе экспрессии белка каждой конструкции была испытана в BL21 (DE3) E.кишечной клетки. Клетки выращивали в ТБ среде с добавлением Novagen Ночной экспресс 1 средний (в соответствии с протоколом производителя) в течение 48 часов при 20 ° C при встряхивании на инкубаторе при 220 оборотах в минуту. После культивирования клетки собирали и тестировали на экспрессии растворимого белка с помощью капиллярного электрофореза с суппорт LabChip 90. Четырнадцать из тридцати четырех PB2 конструкций привело к растворимым белком-мишенью и вступил крупномасштабных брожения. Крупномасштабные культур каждой конструкции были выращены в ТБ среде с добавлением Ночной экспресс Novagen в 1 средний в соответствии с протоколом производителя. После культивирования клетки собирали центрифугированием и хранили при -80 ° С. Крупномасштабные экспрессии белка каждой культуры была подтверждена с помощью SDS-PAGE анализ (рис. 5) перед выполнением крупномасштабных очистки. Белки чайник был использован для проведения параллельной очистки четырнадцать PB2 конструкций. Очищенная лизатам др.L четырнадцать конструкции были проходить через никель-хелатной колонке. После определения того, какие фракции содержат белок-мишень в ДСН-ПААГ, соответствующие фракции объединяли для каждого образца и концентрацию каждого определялась 280 считывания. Удаление 6х His-Smt тег проводили добавление ULP1 последующим диализа в течение ночи и второй столбец никель. Подтверждение His-Smt тег удаление проводили SDS-PAGE (фиг. 6), и каждый образец концентрировали на Amicon 10 кДа Ультра центрифужную пробирку. После концентрирования помощью Amicon Ультра центрифужные пробирки, каждый образец был запущен на размеры колонки для достижения кристаллографической чистоты. Вторая концентрация были проведены для повышения концентрации белка до уровня, необходимого для кристаллизации. Все четырнадцать конструкции были успешно очищается и вступил в кристаллизации испытаний. Кристаллизацию инициируют оттаиванием ранее фрОзень белка. Кристаллизация проводилась в условиях контролируемой комнате при 16 ° С со специально разработанными пластин (Emerald био) для сидения падение диффузии водяного пара (рис. 7). Первоначальный отбор проводился с четырьмя разреженных матриц экранов; JCSG +, пакт, мастер полном объеме, и CryoFull (Emerald BIO), после расширенной стратегии Ньюмен. 0,4 мкл раствора белка была затем смешивали с 0,4 мкл crystallant (или резервуар раствора) из соответствующего резервуара использованием 96-луночных Компактный младший кристаллизации пластин (Emerald Bio). Из четырнадцати очищенные образцы девять из них дали кристаллы, пригодные для исследования дифракции (рис. 8). В доме дифракции набор данных был собран на пяти из девяти конструкциями кристаллизовались при Cu К диапазон частот с помощью Ригаку SuperBright FR-E + с вращающимся анодом рентгеновский генератор оснащен осмиевой VARIMAX HF оптики и Сатурн 944 + CCD детектором (рис. 9 ). Каждый набор данных был обработан с XDS / XSCALE 4 &lt;<html> / Вир&gt; и масштабируется до принятия окончательного решения. Попытки решить структур молекулярного замещения проводились с Phaser 5 из CCP4 люкс 7. Окончательные модели были получены после уточнения в REFMAC 7 и ручное восстановление с Кут 11. Структуры были оценены и с поправкой на геометрию и фитнес-центр с MolProbity 9. Общей сложности четыре структуры PB2 субъединицы были определены (рис. 10) и хранение в PDB. Рисунок 11 иллюстрирует общий результат на каждом этапе в трубопровод МТПП. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> Рисунок 1. Обзор SSGCID гена на элемент структуры путем для нескольких целей параллельной обработки на Изумрудном Bio. Содержание &quot;FO: держать-together.within-страницы =&quot; всегда &quot;&gt; <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> Рисунок 2. Выравнивание и просмотра Белки Построить модуль проектирования программного обеспечения в генной Composer. Аминокислотный построить базу целевых показана на зеленый (среднее окно) и структуры управляемых усечения альтернативных конструкций показаны на золото (нижнее окно). Выравнивание нескольких гриппа вирусного PB2 последовательности показана сравнению с последовательностью и элементов вторичной структуры С-концевой домен из PDBID 3CW4. Знание доменной структуры и элементы вторичной структуры позволяет N-концевые усечения должны быть выбраны в течение расчетного модуля композитор Гена щелкнув правой кнопкой мыши на нужном аминокислотный остаток. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . Рисунок 3а. Труб клонирование проиллюстрировано, где синтетический вставки гена (оранжевый) усиливается предназначенный вперед (красно-оранжевого линии) и обратный (оранжево-синие линии) праймеры для генерации вставить ПЦР материала. Вектор экспрессии амплифицированных с обратным (красно-черных линий ) и вперед (сине-черные линии) затравки при векторе ПЦР материала. Конечных продуктов последовательностей IPCR дополняют концевые последовательности продуктов vPCR (красный IPCR дополняет красный vPCR и синий IPCR дополняет синее vPCR). Это позволяет IPCR и vPCR продукты для отжига с образованием плазмиды, которые реплицируются на превращение в хозяина BL21 (DE3) химически компетентных E. кишечной клетки. <img alt="Рисунок 3b" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> Рисунок 3b. Агарозном геле анализ IPCR производства<html> тс из PB2 субъединицы. IPCR неудачи можно рассматривать как слабые или грязный полосы, в то время как успешные продукты IPCR представлены надежные групп. IPCR качества продукции в общем случае может быть связано с клонирование успеха. Молекулярные маркеры вес в килодальтонах. Рисунок воспроизведен из Raymond соавт., 2011 12. <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> Рисунок 4. Генноинженерные шаги целевых PB2 белка проводили с использованием программного обеспечени дл генного композитора. После инженерии последовательности нуклеиновой кислоты была создана для каждого целевого 6-7 альтернативные конструкции белка были разработаны для каждого из них. Многоцелевой параллельной обработки на начальных этапах проектных и клонирования генов привело к конструкции 34, 14 из которых были жизнеспособны цели, которые производятся растворимых белков в E. палочки. <html> Re 5 &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; Рисунок 5. Представитель SDS-PAGE анализа больших масштабов ферментацию показывает сильную экспрессию белка (ожидаемый размер 25,76 кДа), что примерно на 50% растворимый (дорожка 4) и около 50% расщепление 6х His-метку из Smt элюированный белок (дорожка 7). <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> Рисунок 6. SDS-PAGE результаты для трех конструкций полимеразы PB2 субъединицы Lane 1, молекулярно-массового маркеров (обозначенный в левой кДа). Дорожки 2, 6 и 10, объединенных белка из никеля 1 колонны; дорожках 3, 7 и 11, проточный расщепленного белка в буфере из никеля 2; дорожки 4, 8 и 12, удаление 6х His-Smt тег в буфер Б из никеля 2. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; Рисунок 7. Схема диффузии паров сидит капельным методом. Капельным методом сидели для кристаллизации белков подпадает под категорию диффузии пара. Этот способ влечет за собой очищенный образец белка и осадителя, чтобы уравновесить с большой резервуар, содержащий аналогичных условиях в более высокой концентрации. Поскольку вода испаряется из образца белка и переводах в водохранилище, осадка концентрация увеличивается до оптимального уровня для кристаллизации белков. <img alt="Рисунок 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> Рисунок 8. Белковых кристаллов полимеразы PB2 субъединицы из штамма вируса гриппа. <img alt="Рисунок 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> Рисунок 9. Рентгеноструктурный изображение полимеразы PB2 субъединицыштамма вируса гриппа. <img alt="Рисунок 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> Рисунок 10. Лента диаграммы молекул в кристалле асимметричный блок 4 PB2 структур. Вторичные структуры окрашены в радужной шаблон с соответствующими кодами PDB. (А) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (б) 3KHW (A / Мексика / InDRE4487/2009/H1N1) (с) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (D) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="Рисунок 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> Рисунок 11. Результат анализа для гриппа PB2 цели способами, описанными. Структурнотрубопровода электронной определение проиллюстрировано на пять шагов: клонирование, растворимость, очистки, кристаллизации и определения структуры.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Структура проектирования на основе наркотиков играет важную роль в разработке лекарственных препаратов. Занимаясь несколько целей параллельно значительно увеличивает шансы на успех для свинца открытие. В следующей статье подчеркивается, как Сиэтл структурной геномике центра инфекционных болезней использует мульти-целевого подхода для генной к определению структуры PB2 гриппа субъединицы.

Многоцелевой параллельный подход для обработки Гена на элемент структуры Определение гриппа с использованием полимеразной PB2 субъединицы

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Использование изображений Биолюминесцентный по расследованию синергизм между Пневмококк И вируса гриппа А в младенческой Мыши

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Количественный анализ всех гриппа типа Вирусный Hemagglutinins и нейраминидазы использованием универсального антител в простом Анализы Blot Слот

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinity очистки вируса гриппа рибонуклеопротеидных комплексов с хроматина инфицированных клеток

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Интраназального введения рекомбинантного гриппа вакцин в химерных мышей Модели для изучения слизистых оболочек

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-иммунопреципитации белка мыши MX1 с вирусом гриппа А нуклеопротеидную

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Носовые салфетки для гриппа обнаружения вируса и изоляции от свиного

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Миниатюризированное Glycan Microarray Анализ для оценки авидности и специфичность вируса гриппа А агглютинины

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro разборке вируса гриппа капсиды по градиентное центрифугирование

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Флуоресцентный на основе нейраминидазы Анализ ингибирования для оценки восприимчивости вирусов гриппа к нейраминидазы Ингибитор классу противовирусных препаратов

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...