Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
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Los autores desean agradecer a todos los miembros del consorcio SSGCID. El logro de los objetivos de la SSGCID es posible gracias a los enormes esfuerzos de todos los miembros del equipo en Emerald Bio. Esta investigación fue financiada bajo el contrato No. HHSN272200700057C Federal del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud y el Departamento de Salud y Servicios Humanos.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

Los autores son empleados de Emerald Bio, Inc.

Multi-Target procesamiento paralelo El diseño de fármacos basado en la estructura juega un papel importante en el descubrimiento de fármacos. El SSGCID se dedica a proporcionar a la comunidad científica con estructuras de proteínas en tres dimensiones del NIAID Categoría AC patógenos. Hacer tal información estructural ampliamente disponible en última instancia servirá para acelerar la estructura basada en el diseño de fármacos. El primer paso crítico del enfoque MTPP es el diseño de constructo. Varias construcciones de cada proteína diana aumenta la probabilidad de éxito de la determinación de la estructura y aumenta la respuesta. Es inevitable que algunas construcciones de proteína se producirá un error en las etapas de la tubería. Aplicación del método de clonación TUBO soporta el método de MTPP por lo que permite la generación de muchas construcciones en formato de 96 pocillos sin pasos de purificación intensivos en mano de obra. Emparejamiento de clonación tubo con la capacidad de analizar la expresión de proteínas en el mismo formato de 96 pocillos (Pinza de laboratorioViruta 90) agiliza aún más el flujo global. El emparejamiento de estos métodos permite la rápida identificación de los constructos que producen proteína soluble que asegura el éxito de la producción de proteínas a gran escala y purificación. Un aspecto esencial para el éxito de la MTPP de alto rendimiento es el fabricante de la proteína (patente de EE.UU. N º 6.818.060, Esmeralda Bio) instrumento. El fabricante de proteína es un sistema de cromatografía líquida-paralelo de 24 canales diseñado específicamente para aumentar la eficiencia de la producción de proteínas de alto rendimiento y aplicaciones de la investigación genómica estructural de tuberías relacionadas. Utilizando el protocolo descrito anteriormente para el fabricante de la proteína, las ventajas son evidentes en comparación con un único sistema de FPLC de línea. Una sola persona puede purificar hasta 48 objetivos en paralelo dentro de un período de ocho horas. Por el contrario, una sola persona que utiliza un único sistema FPLC línea sólo puede purificar un máximo de cuatro objetivos dentro de ese mismo plazo. Los altos niveles de pureza para cada objetivoconsigue con el Hacedor de proteínas son un factor crítico en el éxito posterior de crecimiento de cristales de proteínas para el análisis de estructuras. Limitaciones y problemas Resolución de estructuras tridimensionales mediante cristalografía de rayos X es un esfuerzo multi-etapas con muchos retos, uno de los cuales es la incapacidad para obtener grandes cantidades de proteína diana soluble. Una estrategia que puede ser implementado para superar el problema de solubilidad es el uso de un huésped de expresión E. como alternativa células de E. coli son incapaces de realizar varias importantes modificaciones postraduccionales eucariotas. La expresión en diversos levadura, líneas celulares de insecto y de mamífero que son capaces de llevar a cabo estas modificaciones post-traduccionales son a menudo una alternativa adecuada. Las proteínas diana se expresan a veces, pero completamente insoluble en las condiciones de lisis estándar. El fabricante de proteína puede ser un recurso valioso para la prueba rápida de las condiciones de lisis celular alternativoscomo se describe en Smith et al. 2011 13. Esta estrategia es a menudo necesario para mantener objetivos moviéndose a través de la tubería. En cualquier línea de la genómica estructural, protocolos estandarizados pueden no ser adecuadas para todos los objetivos que viene a través de la tubería y los objetivos pueden necesitar optimización individual. Por ejemplo, se ha optado por utilizar el 20% de etilenglicol por cada crioprotector. En los casos en que esta condición no es adecuado, pueden necesitar ser probado crioprotectores o concentraciones alternativas. Debido a la naturaleza única de cada objetivo proteína individual, la limitante de la velocidad y el paso impredecible en la determinación de una estructura es la cristalización. Los desplazamientos de tuberías MTPP la frecuencia baja tasa de éxito de cristalización de proteínas con la optimización de las pantallas iniciales matrices dispersas. Cada cristal inicial golpear las pantallas de matriz dispersa disponibles en el mercado se ha optimizado aún más con un generador de E-Screen (Emerald Bio). La pantalla de optimización está diseñado arONIDO la condición de la exitosa cristal inicial, la alteración de las concentraciones de los tampones, sales, y aditivos. Pantallas de optimización exitosos producen cristales adecuados para estudios de difracción y la determinación de la estructura. El programa de genómica estructural presentado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) provee fondos para Emerald Bio y otras tres instituciones del noroeste del Pacífico, que en conjunto son la SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, la Universidad de Washington y el Laboratorio Nacional del Pacífico Noroeste) . Cada miembro del consorcio fue seleccionado por su experiencia en la aplicación de tecnologías de última generación necesarios para el cumplimiento de los objetivos del programa de genómica estructural NIAID. Hasta la fecha, SSGCID ha depositado 461 estructuras en el ranking de AP como el séptimo mayor contribuyente en el mundo, y en 2011, la más productiva. Los protocolos y metodologías de la SSGCID se proporcionan con la intención de beneficiar a lacomunidad científica y la perpetuación de la investigación de las enfermedades infecciosas.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

Brotes pandémicos de las cepas de influenza altamente virulentas pueden causar morbilidad y mortalidad generalizada en las poblaciones humanas en todo el mundo. Sólo en los Estados Unidos, un promedio de 41.400 muertes y 1.860.000 hospitalizaciones se deben a infección por virus de la gripe cada año 1. Las mutaciones puntuales en la proteína básica de la polimerasa subunidad 2 (PB2) se han relacionado con la adaptación de la infección viral en seres humanos 2. Los resultados de tales estudios han puesto de manifiesto la importancia biológica de PB2 como un factor de virulencia, destacando así su potencial como una diana de fármaco antiviral. El programa de genómica estructural presentado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) provee fondos para Emerald Bio y otras tres instituciones del noroeste del Pacífico que componen el Centro de Genómica Estructural Seattle de Enfermedades Infecciosas (SSGCID). El SSGCID se dedica a proporcionar a la comunidad científica threestructuras de proteínas e-dimensionales de NIAID Categoría AC patógenos. Hacer tal información estructural disponible para la comunidad científica sirve para acelerar la estructura basada en el diseño de fármacos. El diseño de fármacos basado en la estructura juega un papel importante en el desarrollo de fármacos. La búsqueda de objetivos múltiples en paralelo aumenta considerablemente las posibilidades de éxito para el nuevo descubrimiento de cabezas apuntando a un camino o una familia de proteínas entero. Esmeralda Bio ha desarrollado una canalización de procesamiento paralelo de alto rendimiento, multi-objetivo (MTPP) para la determinación de genes a la estructura de apoyo del consorcio. Aquí se describen los protocolos utilizados para determinar la estructura de la subunidad PB2 de cuatro diferentes cepas de la gripe.

Los siguientes resultados ilustran los resultados esperados del protocolo descrito, y en el caso de PB2, los resultados observados. Usando Compositor Gene, cinco secuencias de aminoácidos diana de longitud completa de la influenza virus polimerasa subunidad PB2 fueron diseñadas (Figura 2). Las secuencias fueron PB2 volver traducidos y sometidos a muchas medidas de ingeniería 3, dando lugar a secuencias de codones armonizadas optimizados para la expresión en E. coli. Desde los productos iPCR (Figura 3b), un total de treinta y cuatro construcciones se clonaron con éxito en un sistema de vector pET28 modificado 10 con un N-terminal de 6x His-Smt marcador de fusión Uso del tubo de clonación 3 como se muestra en la Figura 3a. Un resumen de la clonación de flujo de trabajo se presenta en la Figura 4. Después de la clonación con éxito, expresión de la proteína de micro-escala de cada construcción se ensayó en células BL21 (DE3) de E.células de E. coli. Las células se cultivaron en medio TB suplementado con Novagen noche a la mañana Express 1 medio (de acuerdo con el protocolo del fabricante) durante 48 horas a 20 ° C en un conjunto incubador con agitación a 220 rpm. Después del crecimiento, las células se recogieron y se ensayaron para la expresión de proteína soluble utilizando electroforesis capilar con una pinza de LabChip 90. Catorce de los treinta y cuatro PB2 constructos dirigidos a la proteína diana soluble y entró en fermentación a gran escala. Cultivos a gran escala de cada construcción se cultivaron en medio TB suplementado con 1 noche a la mañana medio de Novagen urgente según el protocolo del fabricante. Después del crecimiento, las células se recogieron por centrifugación y se almacenaron a -80 ° C. La expresión de proteínas a gran escala de cada cultivo se confirmó a través de análisis de SDS-PAGE (Figura 5) antes de proceder con la purificación a gran escala. El fabricante de proteína se utiliza para llevar a cabo la purificación paralela de los catorce constructos PB2. Los lisados ​​clarificados de all catorce construcciones se llevaron a cabo a través de una columna de níquel-quelato. Después de determinar que fracciones contenía proteína diana por SDS-PAGE, las fracciones correspondientes se combinaron para cada muestra y la concentración de cada uno se determinó por una A 280 lectura. La eliminación de la etiqueta 6x His-Smt se llevó a cabo mediante la adición de Ulp1 seguido por diálisis durante la noche y una segunda columna de níquel. La confirmación de la eliminación de etiquetas de His-Smt se llevó a cabo por SDS-PAGE (Figura 6), y cada muestra se concentró con un tubo de centrífuga kDa Amicon Ultra 10. Después de la concentración usando los tubos de centrífuga Amicon Ultra, cada muestra se llevó a cabo sobre una columna de dimensionamiento para lograr la pureza cristalográfica. Una segunda concentración se llevó a cabo para aumentar la concentración de proteína a un nivel necesario para la cristalización. Los catorce construcciones se purificaron con éxito y entró en ensayos de cristalización. La cristalización se inició por la descongelación previamente frproteína ozen. La cristalización se lleva a cabo en una habitación de clima controlado a 16 º C con placas especialmente diseñadas (Esmeralda Bio) para la difusión de vapor de gota sentado (Figura 7). La selección inicial se realizó con cuatro pantallas de matriz escasa; JCSG +, Pacto, Wizard completo y CryoFull (Emerald Bio), siguiendo una estrategia de Newman extendida. 0,4 l de solución de proteína se mezcló entonces con 0,4 l de crystallant (o solución de reserva) desde el depósito correspondiente usando placas de cristalización Jr de 96 pocillos compactos (Esmeralda Bio). De los catorce muestras purificadas nueve de ellos produjo cristales adecuados para estudios de difracción (Figura 8). Un conjunto de datos de difracción en-casa se ​​recogió en cinco de las nueve construcciones cristalizadas en Cu radiación K alfa de longitud de onda usando un generador de rayos X Rigaku ultrabrillante FR-E + rotativo-ánodo equipado con Osmic VariMAX HF óptica y un detector de Saturno 944 + CCD (Figura 9 ). Cada conjunto de datos se procesa con XDS / XSCALE 4 &lt;<html> / Sup&gt; y ampliarse a una resolución final. Los intentos para resolver las estructuras por reemplazo molecular se llevaron a cabo con Phaser 5 de la CCP4 suite de 7. Los modelos finales se obtuvieron después de refinamiento en REFMAC 7 y reconstrucción manual con focha 11. Las estructuras fueron evaluados y corregidos por la geometría y de la aptitud con MolProbity 9. Se determinó un total de cuatro estructuras de la subunidad PB2 (Figura 10) y se deposita en el AP. Figura 11 ilustra el resultado general en cada etapa de la tubería MTPP. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> Figura 1. Descripción general de la gen-a-estructura SSGCID vía para el procesamiento paralelo de múltiples objetivo en el Emerald Bio. contenido &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="La figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> Figura 2. Visor de Alineación y Protein Design Construct módulo de software Compositor Gene. Base de amino-ácido constructo de destino se muestra en verde (ventana del medio) y la estructura de los truncamientos guiadas de construcciones alternativas se muestran en oro (ventana inferior). Un alineamiento de múltiples secuencias de la gripe virales PB2 se muestra en comparación con la secuencia y elementos de estructura secundaria del dominio C-terminal de 3CW4 PDBID. El conocimiento de la estructura de dominios y elementos de estructura secundaria permite truncamientos N-terminal a elección dentro del módulo Diseño Compositor Gene, haga clic en el residuo de aminoácido deseado. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . La Figura 3a. TUBO clonación se ilustra en la que la inserción de genes sintéticos (naranja) se amplifica por diseñadas forward (líneas de color rojo-naranja) y atrás primers (líneas naranja y azul) para generar insertar material de PCR. El vector de expresión se amplifica con líneas inversa (rojo-negro ) y forward (líneas de color negro azulado) primers para generar material de vectores PCR. Las secuencias de los productos de iPCR terminales son complementarias a las secuencias terminales de productos vPCR (rojo de iPCR complementa rojo de vPCR y azul de iPCR complementos de azul de vPCR). Esto permite que los productos iPCR y vPCR a hibridan para formar plásmidos que se replican después de la transformación en el huésped BL21 (DE3) de E. químicamente competente células de E. coli. <img alt="Figura 3b" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> La Figura 3b. Análisis en gel de agarosa de iPCR producción<html> ts de la subunidad PB2. iPCR fallos pueden ser vistos como bandas débiles o graso, mientras que los productos iPCR exitosos están representados por bandas robustas. la calidad del producto iPCR generalmente se puede correlacionar con el éxito de clonación. Marcadores de peso molecular están en kilodaltons. La figura se reproduce de Raymond et al., 2011 12. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> La Figura 4. Pasos de ingeniería de genes de proteínas PB2 objetivo se realizaron utilizando el software Compositor Gene. Después de que se estableció la secuencia de ácido nucleico de ingeniería para cada objetivo, 6-7 construcciones alternativas de proteínas se han diseñado para cada uno. El procesamiento en paralelo de múltiples objetivo en los pasos iniciales de diseño de genes y clonación resultó en 34 construcciones, 14 de los cuales eran objetivos viables que producen proteínas solubles en E. coli. <html> re 5 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Representante análisis de SDS-PAGE de fermentación a gran escala que muestra la expresión de proteína sólida (tamaño esperado de 25,76 kDa), más o menos 50% soluble (carril 4) y alrededor de 50% de escisión de la etiqueta 6x His-Smt de proteína eluida (carril 7). <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> La Figura 6. Resultados de SDS-PAGE para tres constructos de la subunidad PB2 de polimerasa carril 1, marcadores de peso molecular (marcados a la izquierda en kDa);. Carriles 2, 6, y 10, proteína agrupada procedente de la columna de níquel 1; carriles 3, 7, y 11, flujo a través de la proteína escindida en tampón A de níquel 2, carriles 4, 8, y 12, la eliminación de la etiqueta 6x His-Smt en tampón B a partir de níquel 2. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Un esquema de difusión de vapor por el método de la gota que se sienta. El método de la gota que se sienta para la cristalización de proteínas cae dentro de la categoría de difusión de vapor. Este método se basa en una muestra purificada de la proteína y precipitante que se equilibre con un depósito más grande que contiene condiciones similares en una concentración más alta. Cuando el agua se evapora de la muestra de proteína y traslados al depósito, la concentración de precipitación se incrementa a un nivel óptimo para la cristalización de proteínas. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> Figura 8. Proteína de cristal de la polimerasa subunidad PB2 de una cepa de virus de la gripe. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> La Figura 9. Imagen de difracción de rayos X de la polimerasa subunidad PB2 de uncepa del virus de la influenza. <img alt="Figura 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> La Figura 10. Diagramas de cinta de las moléculas en la unidad asimétrica cristalográfica de 4 PB2 estructuras. Estructuras secundarias en el patrón de colores del arco iris con los códigos PDB correspondientes. (A) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / Mexico / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="Figura 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> La Figura 11. El análisis de resultados de la influenza PB2 objetivos de los métodos descritos. La estructuracióntubería de determinación de correo se ilustra en cinco pasos: determinación Clonación, solubilidad, purificación, cristalización y la estructura.

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Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

El diseño de fármacos basado en la estructura juega un papel importante en el desarrollo de fármacos. La búsqueda de objetivos múltiples en paralelo aumenta considerablemente las posibilidades de éxito para la detección de plomo. El siguiente artículo pone de relieve cómo el Centro de Genómica Estructural Seattle de Enfermedades Infecciosas utiliza un enfoque multi-objetivo para la determinación genética de la estructura de la influenza A subunidad PB2.

Multi-objetivo enfoque de procesamiento paralelo para Gene a la estructura de determinación de la polimerasa subunidad PB2 Influenza

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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