Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Författarna vill tacka alla medlemmar i SSGCID konsortiet. Achievement av SSGCID mål görs möjlig genom de enorma ansträngningar av alla gruppmedlemmar på Emerald Bio. Denna forskning har finansierats inom ramen för Federal Contract No HHSN272200700057C från det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar, National Institutes of Health och Department of Health and Human Services.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

Författarna är anställda i Emerald Bio, Inc.

Multi-Target Parallel Processing Struktur-baserade läkemedlet design spelar en viktig roll i läkemedelsutveckling. Den SSGCID är dedikerade till att erbjuda den vetenskapliga samfundet med tredimensionell proteinstrukturer från NIAID klass AC patogener. Att göra sådan strukturell information allmänt tillgänglig i slutändan kommer att tjäna till att påskynda struktur-baserade läkemedlet design. Den första kritiska steget i MTPP tillvägagångssätt är konstruktion design. Flera konstruktioner av varje målprotein ökar sannolikheten för framgångsrika struktur beslutsamhet och ökar vändning. Det är oundvikligt att vissa protein konstruktioner kommer att misslyckas under skeden av rörledningen. Genomförandet av metoden PIPE kloning stöder MTPP metoden genom att tillåta generering av många konstruktioner i 96-brunnars format utan arbetsintensiva reningssteg. Para PIPE kloning med förmåga att analysera proteinexpression i samma 96-brunnsformat (Caliper LabChip 90) påskyndar ytterligare det totala flödet. Ihopkopplingen av dessa metoder möjliggör en snabb identifiering av konstruktioner som producerar lösligt protein som säkerställer framgången för storskalig proteinproduktion och rening. En viktig aspekt för framgång MTPP hög genomströmning är Protein Maker (US patent nr 6.818.060, Emerald Bio) instrument. Den Protein Maker är en 24-kanals parallell vätske-kromatografi system som utvecklats speciellt för att öka effektiviteten i hög genomströmning protein produktion och tillhörande strukturella genomiska rörlängder forskning. Med det tidigare beskrivna protokollet för Protein Maker, fördelarna är uppenbara i jämförelse med en enda rad FPLC-system. En enda person kan rena upp till 48 mål i parallella inom en åtta timmars period. Däremot kan en enskild person som använder ett enda system linje FPLC renar endast maximalt fyra mål inom samma tidsram. De höga nivåerna av renhet för varje måluppnås med Protein Maker är en kritisk faktor för senare framgång växande proteinkristaller för strukturanalys. Begränsningar och felsökning Lösa tredimensionella strukturer av röntgenkristallografi är en multi-iscensatt insatser med många utmaningar, varav en är en oförmåga att få stora mängder lösligt målprotein. En strategi som kan genomföras för att övervinna lösligheten problemet är användningen av en alternativ expressionsvärd som E. coli-celler inte kan utföra flera viktiga eukaryota post-translationella modifieringar. Uttryck i olika jäst-, insekts-och däggdjurs-cellinjer som är kapabla att utföra dessa posttranslationella modifikationer är ofta ett lämpligt alternativ. Målproteiner uttrycks ibland men helt olösligt i de vanliga lys villkor. Den Protein Maker kan vara en värdefull resurs för snabb testning av alternativa villkor cellyseringsåsom beskrivs i Smith et al. 2011 13. Denna strategi är ofta nödvändigt att hålla mål rör sig genom rörledningen. I varje strukturell genomik pipeline, kan standardiserade protokoll inte vara lämplig för varje mål som kommer genom rörledningen och målen kan behöva individuell optimering. Till exempel har vi valt att använda 20% etylenglykol för varje frysskyddsmedel. I fall att detta villkor inte är lämpligt, får alternativa kryoskyddsmedel eller koncentrationer behöva testas. På grund av den unika karaktären av varje individuellt protein-målet, är det hastighetsbegränsande och oförutsägbara steg för att fastställa en struktur kristallisation. De MTPP pipeline förskjuter den allmänt låga andelen framgångsrika proteinkristallisering med optimering av de ursprungliga gles matris skärmar. Varje initial kristall hit från kommersiellt tillgängliga gles matris skärmar optimeras ytterligare med en E-Screen Builder (Emerald Bio). Optimeringen Skärmen är konstruerad ARound tillståndet hos den initiala kristall träff, ändring av koncentrationerna av de buffertar, salter, och tillsatser. Framgångsrik optimering skärmar ger kristaller lämpliga för diffraktionsstudier och struktur beslutsamhet. Structural Genomics program som tas fram av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (NIAID) finansierar Emerald Bio och tre andra Pacific Northwest institutioner som tillsammans utgör SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, University of Washington och Pacific Northwest National Laboratory) . Varje medlem i konsortiet valdes för sin kompetens i tillämpning state-of-the-art teknik som krävs för att uppnå målen i NIAID Structural Genomics programmet. Hittills har SSGCID avsatt 461 strukturer i den preliminära rankingen det som den sjunde största bidragsgivaren i världen, och i 2011, den mest produktiva. De protokoll och metoder för SSGCID är försedda med avsikt att gagnavetenskapliga samfundet och vidmakthålla forskningen av infektionssjukdomar.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

Pandemic utbrott av högvirulenta influensastammar kan orsaka omfattande sjuklighet och dödlighet i mänskliga befolkningar över hela världen. I USA ensam, är ett genomsnitt av 41.400 dödsfall och 1,86 miljon inläggning på sjukhus orsakas av influensavirus infektion varje år 1. Punktmutationer i polymeras grundläggande protein 2 subenhet (PB2) har varit kopplade till anpassning av virusinfektion hos människa 2. Resultaten från dessa studier har avslöjat den biologiska betydelsen av PB2 som virulensfaktor, vilket understryker dess potential som ett antiviralt läkemedel mål. Structural Genomics program som tas fram av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (NIAID) finansierar Emerald Bio och tre andra Pacific Northwest institutioner som tillsammans utgör Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). Den SSGCID är dedikerade till att erbjuda den vetenskapliga samfundet med three-dimensionella proteinstrukturer av NIAID kategori AC patogener. Att göra sådan strukturell information tillgänglig för den vetenskapliga samfundet tjänar till att påskynda struktur-baserade läkemedlet design. Struktur-baserade läkemedlet design spelar en viktig roll i läkemedelsutveckling. Sysslar flera mål samtidigt kraftigt ökar chansen för framgång för nya bly upptäckt genom att rikta en väg eller en hel protein familjen. Emerald Bio har utvecklat en hög genomströmning, multi-mål parallell bearbetning rörledning (MTPP) för gen-till-struktur beslutsamhet att stödja konsortiet. Här beskriver vi de protokoll som används för att bestämma strukturen av PB2 subenheten från fyra olika influensa A-stammar.

Följande resultat illustrerar de förväntade utfallet av den beskrivna protokollet, och i fallet med PB2, de observerade resultaten. Använda Gene Composer, fem fullängds mål aminosyrasekvenserna av influensavirus polymeras subenhet PB2 utformades (Figur 2). De PB2 sekvenserna tillbaka översattes och utsattes för många tekniska steg 3, vilket resulterar i kodon harmoniserade sekvenser optimerade för uttryck i E. coli. Från de IPCR produkter (figur 3b), totalt trettiofyra konstruktionerna framgångsrikt klonades in i en modifierad pET28 vektorsystem 10 med en N-terminal 6x His-Smt fusion tagg med PIPE kloning 3, såsom visas i figur 3a. En sammanfattning av kloning arbetsflödet presenteras i Figur 4. Efter lyckad kloning, var mikroskala proteinuttryck av varje konstruktion testades i BL21 (DE3) E.coli-celler. Celler odlades i TB-medium kompletterat med Novagen Overnight Express ett medium (i enlighet med tillverkarens protokoll) för 48 timmar vid 20 ° C i en skakande inkubator inställd på 220 rpm. Efter tillväxt skördades cellerna och testades med avseende på lösligt protein expression med användning av kapillär elektrofores med en Caliper LabChip 90. Fjorton av de trettiofyra PB2 konstruktioner ledde till lösligt målprotein och trädde storskalig fermentation. Storskaliga kulturer av varje konstruktion odlades i TB-medium kompletterat med Novagen s Overnight Express ett medium enligt tillverkarens protokoll. Efter tillväxt skördades cellerna genom centrifugering och förvarades vid -80 ° C. Storskalig proteinexpression av varje kultur bekräftas via SDS-PAGE-analys (Figur 5) innan man går vidare med storskalig rening. Den Protein Maker användes för att genomföra parallella rening av de fjorton PB2 konstruktioner. Den klarnade lysat av all fjorton konstruktioner kördes genom en nickel-kelat-kolonn. Efter bestämning vilka fraktioner innehöll målproteinet genom SDS-PAGE, var de motsvarande fraktionerna sammanslogs för varje prov och koncentrationen av varje bestämdes genom en A 280 behandlingen. Avlägsnande av 6x His-Smt tagg utfördes genom tillsats av ULP1 följt av dialys över natten och en andra nickelkolonn. Bekräftelse av His-Smt tag bort utfördes genom SDS-PAGE (fig 6), och varje prov koncentrerades med en 10 kDa Amicon Ultra centrifugrör. Efter koncentrering med hjälp av Amicon Ultra centrifugrör blandades varje prov överkörd en dimensionering kolonn för att uppnå kristallografisk renhet. En andra koncentration utfördes för att öka proteinkoncentrationen till en nivå som krävs för kristallisation. Alla fjorton konstruktioner framgångsrikt renade och trädde i kristallisering prövningar. Kristallisation initierades genom att tina den tidigare frOzen proteinet. Kristallisation utfördes i ett klimat kontrollerade rum vid 16 ° C med specialdesignade plattor (Emerald Bio) för sittande droppångdiffusion (Figur 7). Initial screening utfördes med fyra gles-matris skärmar, JCSG +, pakten, Wizard Full och CryoFull (Emerald Bio), efter en längre Newman strategi. 0,4 | il proteinlösning blandades sedan med 0,4 | il crystallant (eller reservoarlösning) från motsvarande reservoaren med hjälp 96-brunnars Compact Jr kristallisations plattor (Emerald Bio). Av de fjorton renade prover nio av dem gav kristaller lämpliga för diffraktionsstudier (Figur 8). En in-house diffraktion datamängd samlades på fem av de nio konstruktioner kristalliseras vid Cu Ka våglängd med en Rigaku SuperBright FR-E + roterande anod X-ray generator utrustad med Osmic Varimax HF optik och en Saturn 944 + CCD-detektor (figur 9 ). Varje datauppsättning bearbetades med XDS / XSCALE 4 &lt;<html> / Sup&gt; och skalas till en slutlig lösning. Försök att lösa de strukturer genom molekylär ersättning utfördes med Phaser 5 från CCP4 suite 7. De slutliga modellerna erhölls efter förfining i REFMAC 7 och manuell ombyggnad med Sothöna 11. Strukturerna bedömdes och korrigerad för geometri och fitness med MolProbity 9. Totalt fyra strukturer PB2 subenheten bestämdes (Figur 10) och deponeras i det preliminära budgetförslaget. Figur 11 visar det samlade resultatet i varje steg i MTPP pipeline. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> Figur 1. Översikt över SSGCID gen-till-struktur bana för Multi-mål parallell bearbetning på Emerald Bio. innehåll &quot;fo: keep-together.within-sida =&quot; alltid &quot;&gt; <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> Figur 2. Alignment Viewer och Protein Konstruera Design Module i Gene Composer. Aminosyra-bas konstruktion av målet visas i grönt (mitt fönster) och strukturen guidade stympningar av alternativa konstruktioner visas i guld (nedre fönstret). En anpassning av flera Flu virala PB2 sekvenser visas jämfört med sekvensen och sekundära element struktur av den C-terminala domän från PDBID 3CW4. Kunskap om domänstrukturen och sekundära element struktur möjliggör N-terminala stympningar som skall väljas inom Gene Composer Design Modul genom att högerklicka på den önskade aminosyraresten. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . Figur 3a. PIPE kloning illustreras vari den syntetiska genen insatsen (orange) är förstärkt med hjälp utformad framåt (röd-orange linjer) och omvänd (orange-blå linjer) primrar för att generera infoga PCR material. Expressionsvektorn förstärks med omvänd (röd-svarta linjer ) och framåt (blå-svarta linjer) primers för att generera vektor PCR material. Den terminala sekvenserna IPCR produkter kompletterar de terminala sekvenserna av VPCR produkter (röd av IPCR kompletterar rött av VPCR och blå IPCR kompletterar blå VPCR). Detta gör att IPCR och VPCR produkter att para bilda plasmider som replikeras efter transformation in i värden BL21 (DE3) kemiskt kompetenta E. coli-celler. <img alt="Figur 3b" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> Figur 3b. Agarosgel analys av IPCR produktion<html> ts från PB2 subenheten. IPCR misslyckanden kan ses som svaga eller smetig band, medan framgångsrika IPCR produkter representeras av robusta band. IPCR produktkvalitet kan i allmänhet korreleras med kloning framgång. Molekylviktsmarkörer är i kilodalton. Figur reproduceras från Raymond et al., 2011 12. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> Figur 4. Genteknik stegen av mål PB2 proteiner utfördes med hjälp av programvara Gene Composer. Efter den manipulerade nukleinsyrasekvensen fastställdes för varje mål, var 6-7 alternativa proteinkällor konstruktioner utformade för varje. Multi-mål parallell bearbetning i de inledande stegen av gen design och kloning gav 34 konstruktioner, av vilka 14 var livskraftiga mål som producerade lösliga proteiner i E. coli. <html> re 5 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; Figur 5. Representativa SDS-PAGE-analys av storskalig fermentation visar robust proteinuttryck (förväntad storlek av 25,76 kDa), ungefär 50% lösligt (spår 4) och ca 50% spjälkning av 6x His-Smt taggen från eluerade proteinet (spår 7). <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> Figur 6. SDS-PAGE resultat för tre konstruktioner av polymeras PB2 subenheten Lane 1, molekylvikt markörer (märkt på vänster sida i kDa),. Spår 2, 6 och 10, poolade protein från Nickel 1 kolumn, raderna 3, 7, och 11, genomströmning av klyvda proteinet i buffert A från Nickel 2, fält 4, 8 och 12, borttagande av 6x His-Smt tagg i buffert B från Nickel 2. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; Figur 7. En schematisk av diffusion från sammanträdet drop metoden. Sammanträdet släpp-metoden för proteinkristallisering faller under kategorin av ångdiffusion. Denna metod innebär ett renat prov av protein och fällningsmedel i jämvikt med en större behållare innehållande liknande förhållanden i en högre koncentration. Som vatten förångas från proteinet provet och överför till reservoaren, ökar fällningsmedel koncentration till en optimal nivå för proteinkristallisering. <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> Figur 8. Protein kristall av polymeras PB2 subenheten från en stam av influensavirus. <img alt="Figur 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> Figur 9. Röntgendiffraktion bild av polymeraset PB2 subenheten från enstam av influensavirus. <img alt="Figur 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> Figur 10. Ribbon diagram av molekylerna i den kristallografiska asymmetrisk enhet av fyra PB2 strukturer. Sekundära strukturer färgade i regnbågemönster med motsvarande PDB koder. (A) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / Mexico / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="Figur 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> Figur 11. Utfall analys för influensa PB2 mål genom de beskrivna metoderna. The strukturellte beslutsamhet pipeline visas i fem steg: Kloning, löslighet, rening, kristallisering och strukturbestämning.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Struktur-baserade läkemedlet design spelar en viktig roll i läkemedelsutveckling. Sysslar flera mål samtidigt kraftigt ökar chansen för framgång för bly upptäckt. Följande artikel belyser hur Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease använder en multi-mål-strategi för gen-till-struktur bestämning av PB2 influensa A-subenheten.

Multi-mål Parallel Processing Approach för Gene-till-struktur Fastställande av influensa polymeras PB2 Subenhet

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Använda Bioluminescent Imaging för att undersöka synergi mellan Streptococcus pneumoniae Och influensa A-virus i modersmjölksersättning Möss

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Kvantitativa analyser av alla influensa typ A Viral Hemagglutinins och neuroaminidaser använda Universal antikroppar i enkla mätmetoder Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrening av ribonukleoprotein influensavirus komplex från kromatinet hos infekterade celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration av rekombinant influensavacciner i chimär musmodeller för att studera slemhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation av Mouse Mx1 Protein med influensa A-virus nukleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes för influensa A-virus Upptäckt och isolering från svin

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

En miniatyriserad glykan microarray analys för bedömning Aviditet och specificitet av influensa A-virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

I vitro Demontering av influensa A-virus-kapsider genom gradientcentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescens-baserade neuraminidas Inhibition analys för att bedöma känsligheten hos influensavirus till The neuraminidashämmaren Class of Virushämmande

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...