Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Yazarlar SSGCID konsorsiyumun tüm üyeleri teşekkür etmek istiyorum. SSGCID hedeflerinin başarı Emerald Bio tüm ekip üyelerinin büyük çabaları ile mümkün olmaktadır. Bu araştırma Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar, Sağlık ve Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Enstitüsü Federal Sözleşme No HHSN272200700057C altında finanse edildi.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

Yazarlar Emerald Bio, Inc çalışanları

Çok Hedef Paralel İşleme Yapı-esaslı ecza tasarımı ilaç keşfi önemli bir rol oynar. SSGCID NIAID kategorisi AC patojenlerden üç boyutlu protein yapıları ile bilimsel topluluk sağlamaya adamıştır. Yaygın olarak kullanılan yapısal bilgi yapma sonuçta yapı-bazlı ilaç tasarımı hızlandırmak için hizmet verecek. MTPP yaklaşımın ilk kritik adım yapı tasarımı. Her hedef proteinin birden yapıları başarılı yapı tayini ve artar dönüş olasılığını artırır. Bazı protein yapıları boru hattının aşamalarında başarısız kaçınılmazdır. BORU klonlama yöntemi uygulayan emek yoğun arıtma aşamaları olmadan 96-çukurlu bir biçimde çok yapıların üretimi vererek MTPP yöntemini destekler. Aynı 96-biçimi (Kaliper Laboratuarı&#39;nda protein ekspresyonu analiz yeteneği ile BORU klonlama EşleştirmeChip 90) daha genel akışını hızlandırır. Bu yöntemlerin eşleştirme büyük ölçekli protein üretimi ve arınma başarı sağlayan çözünür protein üretmek yapıları hızlı belirlenmesi için izin verir. MTPP yüksek verimli başarısı için önemli bir yönü Protein Maker (ABD Patent No 6.818.060, Emerald Bio) araçtır. Protein Maker yüksek verimli protein üretimi ve ilgili yapısal genomik boru hattı araştırma uygulamaları verimini artırmak için özel olarak geliştirilmiş bir 24-kanal paralel sıvı kromatografi sistemidir. Protein makinesi için daha önce açıklanan protokol kullanılarak, avantajları tek bir hat FPLC sistemi ile karşılaştırıldığında fark vardır. Tek bir kişi sekiz saatlik süre içinde paralel olarak 48 hedefe kadar arındırmak olabilir. Bunun tersine, tek bir hat FPLC sistemi kullanılarak tek bir kişi, sadece aynı süre içinde dört hedefi azami arıtabilir. Her hedef için saflıkta yüksek düzeydeyapı analizi için artan protein kristalleri daha sonra başarısında kritik bir faktör olan protein Maker ile elde etti. Sınırlamalar ve Sorun Giderme X-ışını kristalografisi ile üç boyutlu yapıları çözme çözünür hedef proteinin büyük miktarda elde etmek için yetersizlik biri pek çok sorun, bir çok aşamalı bir çabadır. Çözünürlük sorunun üstesinden gelmek için uygulanabilecek bir strateji, E. gibi alternatif bir ekspresyon konak, kullanılmasıdır coli hücreleri birçok önemli ökaryotik translasyon sonrası modifikasyonlar yapamazsanız. Bu post-translasyonel modifikasyonlar gerçekleştirme yeteneğine sahip olan çeşitli maya ekspresyon, böcek ve memeli hücre çizgileri genellikle uygun bir alternatiftir. Hedef protein, bazen ifade ancak standart lizis koşullarında tamamen çözünmezler. Protein Makinesi alternatif hücre parçalama koşullarının hızlı test için değerli bir kaynak olabilirSmith, et ​​al. 2.011 13. Bu strateji hedefleri boru hattı boyunca hareket tutmak için gereklidir. Herhangi bir yapısal genomik boru hattı, standart protokoller boru hattı ve hedefleri tek tek optimizasyonu gerekebilir yoluyla gelen her hedef için uygun olmayabilir. Örneğin, her kriyoprotektan için 20% etilen glikol kullanmayı seçtim. Bu durum uygun olmadığı durumlarda, alternatif dondurarak saklama ya da konsantrasyonlar test edilmesi gerekebilir. Her bir protein hedef eşsiz doğası gereği, hız sınırlayıcı ve bir yapı belirlenmesinde öngörülemeyen adım kristalleşme olduğunu. Ilk seyrek matris ekranlarından optimizasyonu ile protein kristalleşme MTPP boru hattı uzaklıklar yaygın olarak düşük başarı oranı. Ticari seyrek matris ekranlarından vurmak Her ilk kristal daha bir E-Screen Builder (Emerald Bio) ile optimize edilmiştir. Optimizasyonu ekran ar tasarlanmıştırtamponlar, tuzlar, ve katkı maddelerinin konsantrasyonları değiştiren, başlangıç ​​kristal hit durumu ound. Başarılı optimizasyon ekranlar difraksiyon çalışmaları ve yapı tayini için uygun kristaller verim. Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü (NIAID) tarafından verilen yapısal genomik programı Emerald Bio ve birlikte SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, Washington Üniversitesi ve Pacific Northwest National Laboratory) olan diğer üç Kuzeybatı Pasifik kurumlara fon sağlar . Konsorsiyumun her üyesi NIAID yapısal genomik programının hedefleri gerçekleştirmek için gerekli state-of-the-art teknolojileri uygulayarak kendi uzmanlık için seçildi. Bugüne kadar, SSGCID dünyanın yedinci en büyük katkı olarak PDB sıralama içine 461 yapıları tevdi etti, ve 2011 yılında, en verimli. SSGCID olan protokolleri ve yöntemleri yararlanma niyeti ile sağlanırbilimsel topluluk ve bulaşıcı hastalıkların araştırma devam ettirmek.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

Son derece öldürücü grip suşları pandemik salgın dünya çapında insan popülasyonlarında yaygın morbidite ve mortaliteye neden olabilir. Amerika Birleşik Devletleri tek başına, 41.400 ölüm ve 1,86 milyon hastaneye yatış ortalama her yıl 1 grip virüsü enfeksiyonu neden olur. Polimeraz temel protein 2 alt biriminin (PB2) içindeki nokta mutasyonlar, insan 2, viral enfeksiyonun, uyum ile bağlantılı olmuştur. Bu çalışmalardan elde edilen bulgular böylece antiviral ilaç hedef olarak potansiyel vurgulayarak, bir virulans faktörü olarak PB2 biyolojik önemi ortaya koymuştur. Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü (NIAID) tarafından verilen yapısal genomik programı Emerald Bio ve birlikte Enfeksiyon Hastalıkları (SSGCID) için Seattle Yapısal Genomik Merkezi oluşturan üç Kuzeybatı Pasifik kurumlara fon sağlar. SSGCID thre ile bilimsel topluluk sağlamaya adamıştırNIAID kategorisi AC patojenlerin E-boyutlu protein yapıları. Bilimsel topluluk için kullanılabilir yapısal bilgi alma yapısı tabanlı ilaç tasarımı hızlandırmak için hizmet vermektedir. Yapı-esaslı ecza tasarımı ilaç gelişmesinde önemli bir rol oynar. Paralel olarak birden çok hedef edinerek büyük bir yol ya da bütün bir protein ailesi hedefleyerek yeni kurşun keşif için başarı şansını artırır. Emerald Bio konsorsiyum destek gen-için-yapı tayini için yüksek verimli, çoklu hedef paralel işlem boru hattı (MTPP) geliştirmiştir. Burada dört farklı influenza A suşları PB2 alt birimi yapısını belirlemek için kullanılan protokolleri tarif.

Aşağıdaki sonuçlar, açıklanan protokol beklenen sonuçları göstermektedir ve PB2, gözlenen sonuçların durumunda. Grip virüsü alt birim polimeraz PB2 beş tam uzunlukta bir hedef amino asit dizileri (Şekil 2) tasarlanmıştır, Gene Besteci kullanarak. PB2 dizileri geri çevrilir ve bir çok mühendislik adım 3 tabi tutuldu E. ekspresyon için optimize edilmiş kodon uyumlu dizileri elde edilmiştir coli. IPCR ürünleri (Şekil 3b) otuz dört tane yapısının toplam başarıyla içinden Şekil 3a&#39;da gösterildiği gibi, boru klonlama 3 ile His füzyon tag SMT, bir N-terminal ile modifiye edilmiş bir 6x pET28 vektör sistemi 10 içine klonlandı. Klonlama akışı bir özeti Şekil 4 &#39;de sunulmuştur. Başarılı Klonlama işleminden sonra her bir yapı mikro ölçekli protein ekspresyonu BL21 (DE3) E. test edilmiştircoli hücreleri. Hücreler 220 rpm&#39;de bir çalkalama inkübatör seti içinde 20 ° C &#39;de 48 saat süre ile Novagen Gecelik Express 1 ortamı (üreticinin protokolüne göre) ile desteklenmiş TBC medyumu içinde büyütülmüştür. Büyütmeden sonra, hücreler, bir kaliper LabChip 90 kılcal Elektroforez kullanılarak çözülebilir protein ekspresyonu için hasat edilmiş ve test edildi. Çözünür hedef protein yol açtı ve otuz dört PB2 yapıları on dört büyük ölçekli fermantasyon girdi. Her bir yapı Büyük ölçekli kültürler, üreticinin protokolüne uygun olarak Novagen en Gecelik Hızlı 1 orta TBC ile desteklenmiş ortam içinde büyütülmüştür. Büyütmeden sonra, hücreler santrifüjleme ile hasat edilmiş ve -80 ° C&#39;de saklanır Her bir kültürün büyük ölçekli protein ekspresyonu büyük ölçekli saflaştırma ile devam etmeden önce SDS-PAGE analizi (Şekil 5) ile teyit edilmiştir. Protein Maker on dört PB2 yapıları paralel arıtma yapmak için kullanıldı. Al açıklık lizatlarıl on dört yapıları bir nikel-şelat sütun kadar devam edildi. SDS-PAGE ile hedef protein fraksiyonları ihtiva ettiği tespit edildikten sonra, karşılık gelen her bir örnek için fraksiyonlar toplanmış ve her bir konsantrasyonu A 280 okuma ile tespit edilmiştir. 6x His-etiketi SMT çıkarılması gece boyunca diyaliz ve bir ikinci nikel kolon takip ULP1 ilavesiyle yapılmıştır. His-etiketi kaldırma SMT Onayı, SDS-PAGE (Şekil 6) tarafından yapılan ve her bir örnek, 10 kDa&#39;lık bir Amicon Ultra santrifüj tüpü ile konsantre edildi. Amicon Ultra santrifüj tüpleri kullanarak yoğunlaştırma sonrasında, her bir örnek kristalografik saflık elde etmek için bir boyutlandırma kolonu üzerinde çalıştırıldı. Ikinci bir konsantrasyon kristalizasyon için gerekli olan bir seviyeye protein konsantrasyonunu arttırmak için yapılmıştır. Tüm on dört yapıları başarıyla arıtılmış ve kristalizasyon çalışmalarda girilmiştir. Kristalizasyon önce Fr eritilmesi ile başlatıldıozen protein. Kristalizasyon 16 bir iklim kontrollü odada yapıldı ° C oturan damla buharı difüzyon (Şekil 7) için özel olarak tasarlanmış plakaları (Emerald Bio) ile. İlk tarama dört seyrek-matris ekranı ile yapılmıştır; JCSG +, Paktı, Sihirbazı Tam, ve uzun bir Newman strateji takip CryoFull (Emerald Bio),. Protein çözeltisi, 0.4 ul daha sonra 96 ​​oyuklu Kompakt Jr kristalleştirme levhalar (Emerald Biyo) kullanılarak ilgili rezervuardan crystallant 0.4 ul (ya da hazır olarak bulundurulan çözelti) ile karıştırıldı. On dört saflaştırılmış örneklerin bunlardan dokuz difraksiyon çalışmaları (Şekil 8) için uygun kristaller vermiştir. Içi bir kırınım veri seti Osmik VARIMAX HF optik ve Saturn 944 + CCD dedektör ile donatılmış bir Rigaku süper parlak FR-E + döner-anot X-ışını jeneratörü kullanarak Cu Ka dalga boyunda kristalize dokuz yapıları beş (Şekil 9 toplanmıştır .) Her veri kümesi XDS / XScale 4 ile işlendi &lt;<html> / Sup&gt; ve bir nihai karar için ölçekli. Moleküler değiştirilmesi ile yapı çözmeye çalışır CCP4 süit 7 Phaser 5 ile gerçekleştirilmiştir. Son model REFMAC 7 ve Coot 11 ile manuel yeniden inşa arıtma sonra elde edilmiştir. Yapıları değerlendirildi ve MolProbity 9 ile geometri ve fitness için düzeltildi. PB2 alt birimi dört yapıların toplam belirlenir (Şekil 10) ve PDB yatırılır edildi. Şekil 11 MTPP boru hattı her aşamasında genel sonuç göstermektedir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> Şekil 1. Emerald Bio Çok hedef paralel işlem için SSGCID gen-için-yapı yolu genel bakış. içeriği &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; her zaman &quot;&gt; <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> Şekil 2. Hizalama Viewer ve Protein Gen Composer yazılımı Tasarım Modülü oluşturun. Amino-asit baz yeşil (orta pencere) ve alternatif yapıları yapısı güdümlü truncations altın (alt pencere) gösterilir gösterilmiştir hedef inşa. Birden Grip viral PB2 dizilerinin bir uyum sırası ve ikincil yapı elemanları ile karşılaştırıldığında gösterilir PDBID 3CW4, C-terminal alanı arasında. Etki alanı yapısı ve ikincil yapı elemanlarının Bilgi N-terminal truncations istenilen amino asit kalıntısı sağ tıklayarak Gen Besteci Tasarım Modülü içinde seçilecek sağlar. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . Şekil 3a. BORU klonlama sentetik gen ekleme (turuncu) ileri tasarlanmıştır (kırmızı-turuncu çizgiler) ve üretmek için ters (turuncu-mavi çizgiler) primer PCR malzeme eklemek ile amplifiye neyin gösterilmiştir. Ifade vektörü ters (kırmızı-siyah çizgiler ile yükseltilir ) ve ileri (mavi-siyah çizgiler) astar vektör PCR malzeme oluşturmak için. Terminal dizileri IPCR ürünleri vPCR ürünleri (IPCR kırmızı IPCR bir vPCR ve mavi vPCR mavi tamamlar kırmızı tamamlar) bir terminal dizileri tamamlayıcısıdır. Bu IPCR ve vPCR ürünleri ana BL21 (DE3) kimyasal yetkili E. dönüşüm üzerine çoğaltılır plazmid oluşturmak için tavlama sağlar coli hücreleri. <img alt="Şekil 3b" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> Şekil 3b. IPCR üretimi agaroz jel analizi<html> Başarılı IPCR ürünleri sağlam bantları temsil ise PB2 alt birimi gelen ts. IPCR arızaları, soluk ya da yağlı bantlar olarak görülebilir. IPCR ürün kalitesi genellikle klonlama başarı ile ilişkili olabilir. Molekül ağırlığı işaretleyicileri kiloDalton içindedir. Şekil Raymond ve arkadaşları. 2011 12 yeniden üretilir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> Şekil 4. Hedef gen mühendisliği adımları PB2 protein gen Composer yazılımı kullanılarak yapıldı. Işlenmiş nükleik asit sekansı, her hedef için kurulduktan sonra, 6-7 alternatif protein yapısının her biri için tasarlanmıştır. Gen tasarım ve klonlama ilk adımda çoklu hedef paralel işlem E. çözünür proteinler üretilen uygulanabilir hedefler vardı 14 olan 34 yapıları, sonuçlandı coli. <html> yeniden 5 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; Şekil 5,. Sağlam protein ekspresyonu (25.76 kDa&#39;lık beklenen boyutu), (hat 7) Elüsyonlanan protein, 6x His-etiketi SMT bölünme yaklaşık% 50 çözünür (şerit 4) ile yaklaşık% 50 arası büyük ölçekli fermantasyon Örnek SDS-PAGE analizi. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> 6 Şekil. Polimeraz PB2 alt biriminin üç yapıları için SDS-PAGE sonuçlarını Şerit 1, moleküler ağırlık belirteçleri (kDa olarak solda etiketli);. Şerit 2, 6, 10, 1 Nikel kolondan toplanmış proteini şeritler 3, 7, ve 11. Nikel 2 tampon A içinde yarılan protein akan, şerit 4, 8 ve 12, nikel 2 tampon B 6x His-etiketi SMT çıkarılması. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; Şekil 7. Oturma damla yöntemi ile buhar difüzyon şematik. Protein kristalizasyon için oturma bırak yöntemi buhar difüzyon kategorisinde yer alır. Bu yöntem, protein ve daha yüksek bir konsantrasyonda benzer koşullar içeren bir rezervuar ile daha büyük bir denge sağlaması için çökeltici bir arıtılmış örnek gerektirir. Su protein örnek transfer edilen hazneye buharlaşan olarak, çökeltici konsantrasyonu protein kristalizasyon için bir optimum seviyede artar. <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> Şekil 8. Grip virüsü bir gerginlik polimeraz PB2 alt birim protein kristal. <img alt="Şekil 9," src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> 9 Şekil. Bir ikinci polimeraz PB2 alt biriminin X-ışını kırılma görüntüsününgrip virüsü süzün. <img alt="Şekil 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> 10 Şekil. 4 PB2 yapıların kristalografik asimetrik birimde moleküllerin Şerit diyagramlar. Gelen PDB kodları ile gökkuşağı desen renkli ikincil yapıları. (A) &#39;3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / Meksika / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1), (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="Şekil 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> 11 Şekil. Tarif edilen yöntemler ile grip PB2 hedefler için sonuç analizi. StrüktürlerE belirlenmesi boru hattı beş adımda gösterilmiştir: Klonlama, çözünürlük, saflaştırma, kristalleştirme ve yapı tayini.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Yapı-esaslı ecza tasarımı ilaç gelişmesinde önemli bir rol oynar. Paralel olarak birden çok hedef edinerek büyük ölçüde kurşun keşfi için başarı şansını artırır. Aşağıdaki makale Enfeksiyon Hastalıkları için Seattle Yapısal Genomik Merkezi PB2 influenza A alt birimi gen-için-yapı tayini için bir çoklu hedef yaklaşım kullanır nasıl vurgulamaktadır.

Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Domuz influenza A virüs Algılama ve İzolasyonu için Burun Mendil

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...