Name: extraction of tissue antigens for functional assays
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

ويدعم هذا العمل من المنح المقدمة من الصحة الوطنية الاسترالية ومجلس البحوث الطبية (NHMRC # 559007) والأحداث السكري مؤسسة أبحاث (JDRF 4-2006-1025) ومخطط البنية التحتية التشغيلية لحكومة فيكتوريا. نشكر أعضاء ماندل توم برنامج زرع جزيرة عزل فريق جزيرة لتوفير الأنسجة البشرية. تم جمع الأنسجة البشرية واستخدامها مع الموافقة الأخلاقية المحلية (مستشفى سانت فنسنت HREC-A 011/04 والصحة سانت فنسنت HREC-A 135/08).

1. إعداد الأنسجة الطحال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن يعامل الملاحظات جميع المواد التي قد تكون معدية الإنسان وينبغي أن تجري جميع الإجراءات في مجلس الوزراء من الفئة الثانية تدفق الصفحي. باستخدام مقص ملقط معقم و، وإزالة الأنسجة الدهنية وال?...

<ol>
	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

وقد تم تطوير هذا البروتوكول لأننا أردنا لتوليد مقتطف من الأنسجة البشرية التي كانت خالية من المواد الكيميائية السامة مثل المنظفات. على وجه التحديد وقد استخدمنا ذلك لإعداد مقتطفات من الأنسجة البشرية التي يمكن استخدامها في فحوصات وظائف المناعة البشرية في المختبر.</em...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 5 مل 12 × 75 مم أنابيب معقمة البوليسترين </td><td> BD الصقر </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> قبعات للأنابيب أنابيب البولي ستايرين (أعلاه) </td><td> BD الصقر </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ML أنابيب معقمة </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> الأسيتونيتريل </td><td> كيماويات Mallinckradt </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-OL </td><td> سيغما الدريتش </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> الخالط: PRO200 </td><td> الحيوية الاستراتيجية </td><td> 01-01200 </td><td> 10 × 115 مم المنشار الأسنان مولد </td></tr><tr><td> مجفاد </td><td></td><td></td><td> Virtis، الفوق 4K </td></tr><tr><td> إبرة معقمة قياس 18-20 </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 متوسطة </td><td> سيجما </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> سيجما </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. الكواشف محددة والمعدات.

extraction of tissue antigens for functional assays

العديد من الأهداف مستضد من الاستجابة المناعية التكيفية، معترف بها من قبل والخلايا B T، لم تعرف 1. هذا صحيح بصفة خاصة في أمراض المناعة الذاتية والسرطان 2. هدفنا هو التحقيق في مستضدات الخلايا T التي تعترف بها الإنسان في نوع 1 من داء السكري أمراض المناعة الذاتية 1،3،4،5. لتحليل خلايا T الإنسان استجابات ضد الأنسجة حيث لا تحديد مستضدات الخلايا T معترف بها من قبل وضعنا طريقة لاستخراج البروتين من مولدات المضادات الأنسجة البشرية في تنسيق متوافق مع المقايسات الفنية 6. لا يمكن أن الردود سابقا، T-خلية الأنسجة غير منقى لمقتطفات أن تقاس لأن طرق استخراج تسفر عن المحللة التي تحتوي المنظفات التي كانت سامة للخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى. نحن هنا وصف بروتوكول لاستخراج البروتينات من الأنسجة البشرية في شكل غير سامة للخلايا T الإنسان. والمتجانس النسيج في خليط من الأسيتونيتريل، butan-1-ol و واتإيه (BAW). يتم قياس تركيز البروتين في استخراج أنسجة وaliquoted كتلة معروفة من البروتين في أنابيب. بعد الاستخراج، يتم إزالة المذيبات العضوية من قبل تجفيد. ويمكن تخزين مقتطفات الأنسجة مجفف بالتجميد حتى المطلوبة. لاستخدامها في فحوصات وظائف المناعة، وتعليق من الخلايا المناعية، في وسائل الإعلام الملائمة الثقافة، يمكن إضافة مباشرة إلى استخراج مجفف بالتجميد. تم قياس بسهولة وانتشار إنتاج السيتوكينات بواسطة PBMC، ردا على مقتطفات إعدادها باستخدام هذا الأسلوب. وبالتالي، لدينا أسلوب يسمح للإعداد السريع للأنسجة البشرية لست] التي يمكن استخدامها كمصدر للمستضدات في تحليل الخلايا T-الردود. نقترح أن هذا الأسلوب سيسهل تحليل الاستجابات المناعية التكيفية في زرع الأنسجة لوالسرطان والمناعة الذاتية.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

يوصف بروتوكول بسيط لإعداد مقتطفات من الأنسجة البشرية لاستخدامها كمصدر للمستضدات في المقايسات T-الخلية الوظيفية. هذا الأسلوب يسمح للقياس T-الخلية الردود على الأنسجة المشتقة من المستضدات<em&gt; في المختبر</em&gt;.

استخراج المستضدات لفحوصات الأنسجة وظيفية

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

الضوء / الظلام لاختبار الانتقال الفئران

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

بلورة البروتينات الغشائية لتحديد الهيكل باستخدام Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

فحوصات الوراثية الدوائية وظيفية للتلاعب تجديد مستورقة Dugesia تفرضه اليابان</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

نوعان من فحوصات الكشف عن الضفدع Chemoattraction الحيوانات المنوية

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

على نطاق صغير مقتطفات النووية لفحوصات وظيفي من الجينات التعبير عن مكائن

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Viability Assays for Cells in Culture

فحوصات قابلية للخلايا في الثقافة

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...