Name: extraction of tissue antigens for functional assays
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) en de Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) en de operationele infrastructuur Regeling van de Victoriaanse regering. Wij danken de leden van de Tom Mandel Islet Transplantation Programma Islet Isolatie Team voor het verstrekken van de menselijke weefsels. Menselijke weefsels werden verzameld en gebruikt met de lokale ethische goedkeuring (St. Vincent&#39;s Hospital HREC-A 011/04 en St. Vincent&#39;s Health HREC-A 135/08).

1. Voorbereiden miltweefsel <ol><li> Opmerking-alle menselijke materiaal moet worden behandeld als mogelijk infectieus en alle procedures moeten worden uitgevoerd in een klasse II Laminar Flow kabinet. Met steriele schaar en forceps, verwijder vet en bindweefsel van miltsecties (~ 1-2 cm in grootte) en afsnijden zoveel van de buitenste capsule mogelijk materiaal. </li><li> Snij een klein stukje (1-2 cm 3) van de milt weefsel en plaats elk stuk in een steriele 50 ml Falcon buis. </li><li> De stukjes weefsel ...

<ol>
	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

Dit protocol is ontwikkeld, omdat we wilden een uittreksel uit menselijk weefsel dat was vrij van giftige chemicaliën zoals wasmiddelen te genereren. Specifiek hebben we gebruikt om extracten van humane weefsels die kunnen worden gebruikt in assays van menselijke immuunsysteem in vitro bereiden. Extracten bereid met dit protocol kan ook worden opgelost in een buffer en voor vele biochemische analyses, zoals Western blotting of vloeistofchromatografie. Dit maakt deze techniek voor vele verdere toepassingen. </p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 5 ml 12 x 75 mm polystyreen buizen steriele </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> Caps voor buizen polystyreenbuizen (boven) </td><td> BD Falcon </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml steriele buizen </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> Mallinckradt Chemicals </td><td> 2,856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butaan-1-ol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homogenisator: PRO200 </td><td> Bio-strategie </td><td> 01-01200 </td><td> 10 x 115 mm zaagtandgenerator </td></tr><tr><td> Vriesdroger </td><td></td><td></td><td> Virtis, Benchtop 4K </td></tr><tr><td> Steriele naald 18 tot 20 gauge </td><td> Becton Dickinson </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 Medium </td><td> Sigma </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Specifieke reagentia en apparatuur.

extraction of tissue antigens for functional assays

Veel antigen doelstellingen van adaptieve immuunrespons, die door B en T cellen, niet gedefinieerd 1. Dit geldt met name voor auto-immuunziekten en kanker 2. Ons doel is het onderzoeken van de antigenen herkend door menselijke T-cellen in de autoimmuunziekte type 1 diabetes 1,3,4,5. De menselijke T-cel responsen te analyseren tegen weefsel waar de antigenen herkend door T cellen worden geïdentificeerd we een methode ontwikkeld om eiwitantigenen onttrekken menselijk weefsel in een formaat dat compatibel is met functionele assays 6. Voorheen T-cel responsen op ongezuiverde weefselextracten kon niet gemeten worden omdat de extractiemethoden opleveren lysaat vervat detergentia die toxisch voor menselijke perifere mononucleaire bloedcellen. Hier beschrijven we een protocol voor het extraheren van eiwitten uit menselijk weefsel in een formaat dat niet toxisch is voor humane T-cellen. Het weefsel wordt gehomogeniseerd in een mengsel van butaan-1-ol, acetonitril en water (BAW). De eiwitconcentratie in het weefsel extract wordt gemeten en een bekende massa eiwit verdeeld in buizen. Na extractie wordt de organische oplosmiddelen verwijderd door lyofilisatie. Gevriesdroogd weefselextracten kan worden opgeslagen tot zij nodig zijn. Voor gebruik in assays van de immuunfunctie, een suspensie van immuuncellen, in geschikte kweekmedia, direct kan worden toegevoegd om het gevriesdroogde extract. Cytokineproductie en proliferatie van PBMC als reactie op extracten bereid met deze methode, werden gemakkelijk gemeten. Vandaar onze werkwijze maakt de snelle bereiding van menselijk weefsel lysaten die kunnen worden gebruikt als bron van antigenen in de analyse van T-cel responsen. We suggereren dat deze methode de analyse van adaptieve immuunrespons vergemakkelijken weefsel bij transplantatie, kanker en auto-immuniteit.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Een eenvoudige protocol voor het bereiden van extracten van menselijke weefsels worden gebruikt als bron van antigenen in functionele T-cel-assays beschreven. Deze methode laat T-cel responsen op weefsel afgeleide antigenen te meten<em&gt; In vitro</em&gt;.

Extractie van Tissue Antigens voor functionele testen

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

Licht / donker Overgang test voor Muizen

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actine Co-Sedimentatie Assay, want de analyse van eiwit binding aan F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analyse van de Schwann-astrocyte Interacties gebruik In Vitro Testen

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Farmacologische en Functionele genetische Testen om de regeneratie van de Planarian manipuleren Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Twee Soorten Assays voor het detecteren van Kikker Sperma chemoattractie

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Kleinschalige nucleaire extracten voor functionele testen van gen-expressie Machines

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Viability Assays for Cells in Culture

Levensvatbaarheid Testen voor Cellen in Cultuur

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...