Name: extraction of tissue antigens for functional assays
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00
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Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus dem Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) und der Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) und der betrieblichen Infrastruktur Schema des viktorianischen Regierung unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Tom Mandel Inseltransplantation Programm Inselisolierung Team für die Bereitstellung der menschlichen Geweben. Menschliche Gewebe wurden gesammelt und mit lokalen ethischen Zulassung verwendet (St. Vincent Hospital HREC-A 011/04 und St. Vincent Gesundheit HREC-A 135/08).

Ein. Vorbereiten Milzgewebe <ol><li> Hinweis-all menschlichem Material sollten als potenziell infektiös und alle Verfahren sollten in einer Klasse II Laminar Flow Cabinet durchgeführt werden behandelt werden. Verwendung steriler Schere und Pinzette Fett und Bindegewebe aus Milz Abschnitte (~ 1-2 cm groß) und schneiden Sie so viel von der äußeren Kapsel Material wie möglich. </li><li> Schneiden Sie ein kleines Stück (1-2 cm 3) von Milzgewebe und platzieren Sie jedes Stück in einem sterilen 50 ml-Falc...

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	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

Dieses Protokoll wurde entwickelt, weil wir einen Auszug aus menschlichem Gewebe, die frei von giftigen Chemikalien wie Wasch war erzeugen wollte. Insbesondere haben wir es verwendet, um Auszüge aus menschlichem Gewebe, die in Tests des menschlichen Immunsystems in vitro verwendet werden vorzubereiten. Extrakte hergestellt unter Verwendung dieses Protokolls können gleichermaßen in einem Puffer rekonstituiert werden und für viele biochemische Analysen, wie Western-Blot oder Flüssigkeitschromatographie. Dies...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 5 ml 12 x 75 mm sterile Polystyrolröhrchen </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> Caps für Rohre Polystyrolröhrchen (oben) </td><td> BD Falcon </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml sterilen Röhrchen </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> Mallinckradt Chemicals </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-ol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 537.993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homogenisator: PRO200 </td><td> Bio-Strategie </td><td> 01-01200 </td><td> 10 x 115 mm Sägezahngenerator </td></tr><tr><td> Lyophilizer </td><td></td><td></td><td> Virtis, Benchtop 4K </td></tr><tr><td> Sterile Nadel 18-20 Gauge </td><td> Becton Dickinson </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 Medium </td><td> Sigma </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Spezifisch Reagenzien und Ausrüstung.

extraction of tissue antigens for functional assays

Viele der Antigen-Targets der adaptiven Immunantwort, durch B-und T-Zellen erkannt wird, wurden nicht 1 definiert. Dies gilt insbesondere bei Autoimmunerkrankungen und Krebs 2. Unser Ziel ist es, die Antigene von menschlichen T-Zellen in der Autoimmunerkrankung Typ-1-Diabetes 1,3,4,5 erkannt zu untersuchen. Die menschliche T-Zell-Antworten gegen Gewebe, wo die Antigene durch T-Zellen erkannt werden nicht identifiziert analysieren wir ein Verfahren entwickelt, um Protein-Antigenen aus humanem Gewebe in einem Format, das kompatibel mit funktionellen Assays 6 ist extrahieren. Zuvor T-Zell-Antworten auf ungereinigten Gewebeextrakten konnte nicht gemessen werden, da die Extraktions-Verfahren liefern ein Lysat, daß Waschmittel, die toxisch für humane periphere mononukleare Zellen enthalten sein. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus humanen Geweben in einem Format, das nicht toxisch für humane T-Zellen. Das Gewebe wird in einem Gemisch aus Butan-1-ol, Acetonitril und homogenisiert water (BAW). Die Proteinkonzentration in der Gewebeextrakt gemessen wird und ein bekannter Masse von Protein wird in Röhrchen aliquotiert. Nach der Extraktion werden die organischen Lösungsmittel durch Lyophilisierung entfernt. Lyophilisierte Gewebeextrakten gespeichert, bis sie benötigt werden. Zur Verwendung in Tests der Immunfunktion eine Suspension von Immunzellen in geeigneten Kulturmedien, kann direkt an die lyophilisierte Extrakt zugesetzt werden. Proliferation und Zytokin-Produktion durch PBMC in Reaktion auf Extrakte hergestellt unter Verwendung dieses Verfahrens wurden leicht gemessen. Daher ermöglicht unser Verfahren die rasche Herstellung von menschlichem Gewebe-Lysaten, die als Quelle von Antigenen bei der Analyse der T-Zell-Reaktionen verwendet werden kann. Wir schlagen vor, dass diese Methode die Analyse der adaptiven Immunantwort auf Gewebe in der Transplantationsmedizin, Krebs und Autoimmunität erleichtern.

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Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Ein einfaches Protokoll zur Herstellung von menschlichem Gewebe-Extrakten, die als Quelle von Antigenen in funktioneller T-Zell-Assays verwendet werden beschrieben. Diese Methode ermöglicht es T-Zellen-Reaktionen auf Gewebe stammenden Antigenen zu messenden<em&gt; In vitro</em&gt;.

Extraktion von Tissue Antigens für funktionelle Assays

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

Hell / Dunkel Transition Test für Mäuse

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Forschung

Biologie

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analyse von Schwann-Astrozyten Wechselwirkungen mit In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Zwei Arten von Assays zum Nachweis von Frog Sperm Chemotaxis

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Small-scale Kernextrakten für funktionelle Assays von Gen-Expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Viability Assays for Cells in Culture

Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...