Name: extraction of tissue antigens for functional assays
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהבריאות האוסטרלית הלאומיות והמועצה למחקר רפואי (NHMRC # 559007) וסוכרת נעורי Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) ותכנית התשתיות התפעולית של הממשלה ויקטוריאני. אנו מודים לחברי צוות טום מנדל איילט להשתלות תכנית איילט הבידוד למתן רקמות האדם. רקמות אדם נאספו ושימוש באישור אתי מקומי (בית חולי סנט וינסנט HREC-הבריאות של סנט וינסנט 011/04 וHREC-135/08).

1. הכנת רקמת טחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההערה, כל החומר האנושי יש להתייחס כאל פוטנציאל מדבק וכל ההליכים צריכים להתנהל בקבינט זרימה למינרית שנייה ייצוגי. בעזרת מספריים ומלקחיים סטריליים, הסרת רקמת שומן וסיבית מסעיפי טחול (~ 1-2 סנטימטר בגודל) ?...

<ol>
	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

פרוטוקול זה פותח בגלל שרצינו להפיק תמצית מרקמה האנושית שהייתה חופשי מכימיקלים רעילים כגון חומרי ניקוי. באופן ספציפי יש לנו השתמשנו בו כדי להכין תמצית של רקמה האנושית שניתן להשתמש במבחנים של תפקוד מערכת חיסון של אדם במבחנה. תמציות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה באו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל 12 75 צינורות קלקר סטריליים מ&quot;מ x </td><td> BD פלקון </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> כובעים לצינורות צינורות קלקר (לעיל) </td><td> BD פלקון </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50 מיליליטר צינורות סטריליים </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> כימיקלי Mallinckradt </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-ol </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homogenizer: PRO200 </td><td> Bio-אסטרטגיה </td><td> 01-01200 </td><td> 10 המ&quot;מ x 115 גנרטור משונן </td></tr><tr><td> Lyophilizer </td><td></td><td></td><td> Virtis, Benchtop 4K </td></tr><tr><td> 18-20 מד מחט סטרילית </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני CMRL-1066 </td><td> סיגמא </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> סיגמא </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלת 1. ריאגנטים וציוד ספציפיים.

extraction of tissue antigens for functional assays

רבים מיעדי אנטיגן של תגובה חיסונית אדפטיבית, המוכרים על ידי תאי T, B ולא הוגדרו 1. זה נכון במיוחד במחל אוטואימוניות וסרטן 2. המטרה שלנו היא לחקור את האנטיגנים מוכרים על ידי תאי T אנושיים בסוג המחלה אוטואימונית 1 הסוכרת 1,3,4,5. כדי לנתח את התגובות אנושיות תא T נגד רקמות שבו אנטיגנים המוכרים על ידי תאי T אינם מזוהים פתחנו שיטה לחילוץ אנטיגנים חלבון מרקמה אנושית בתבנית תואמת עם מבחנים תפקודיים 6. תגובות בעבר, תאים-T לתמציות רקמות unpurified לא ניתן היו למדוד, משום ששיטות החילוץ להניב lysate שהכיל חומרי ניקוי שהיו רעילים לתאי דם היקפי אדם mononuclear. כאן אנו מתארים פרוטוקול לחילוץ חלבונים מרקמות אדם בתבנית שאינה רעיל לתאי T אנושיים. רקמת homogenized בתערובת של, אצטוניטריל butan-1-ol וואטאה (Baw). ריכוז החלבון בתמצית הרקמה נמדד ומסה ידועה של חלבון aliquoted לתוך צינורות. לאחר חילוץ, הממסים האורגניים יוסרו על ידי lyophilization. תמציות רקמות Lyophilized ניתן לאחסן עד נדרשים. לשימוש במבחנים של תפקוד מערכת חיסוני, השעיה של תאי חיסון, בתקשורת התרבות המתאימה, ניתן להוסיף ישירות לתמצית lyophilized. ייצור ציטוקינים ושגשוג על ידי PBMC, בתגובה לתמציות שהוכנו באמצעות שיטה זו, נמדדו בקלות. לפיכך, השיטה שלנו מאפשרת הכנה המהירה של lysates רקמות האנושיים שיכול לשמש כמקור לאנטיגנים בניתוח של תגובות תא T. אנו ממליצים כי שיטה זו תאפשר הניתוח של תגובות חיסוניות מסתגלות לרקמות בהשתלה, סרטן והתפתחות מחלה.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

פרוטוקול פשוט להכנת תמציות של רקמה אנושית שתשמש כמקור לאנטיגנים במבחנים תפקודיים תא T מתואר. שיטה זו מאפשרת תגובות תא T לאנטיגנים המופקים מרקמות כדי להימדד<em&gt; במבחנה</em&gt;.

הפקת אנטיגנים רקמות למבחנים פונקציונליים

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

אור / חושך מעבר מבחן עכברים

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

מבחני גנטית תרופתי ו פונקציונלית לתפעל התחדשות של Planarian Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

שני סוגים של מבחני עבור Chemoattraction גילוי זרע צפרדע

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Viability Assays for Cells in Culture

מבחני כדאיות לתאים בתרבית

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...