Name: extraction of tissue antigens for functional assays
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00
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यह काम ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC 559,007) और किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन (4-2006-1025 JDRF) और विक्टोरियन सरकार का परिचालन इन्फ्रास्ट्रक्चर योजना से अनुदान द्वारा समर्थित है. हम मानव ऊतकों प्रदान करने के लिए टॉम मेंडल आइलेट प्रत्यारोपण कार्यक्रम आइलेट अलगाव टीम के सदस्यों को धन्यवाद. मानव ऊतकों एकत्र थे और स्थानीय नैतिक अनुमोदन के साथ इस्तेमाल किया (सेंट विन्सेंट अस्पताल HREC ए / 04 011 और सेंट विन्सेंट स्वास्थ्य HREC - 135/08).

1. प्लीहा ऊतक की तैयारी <ol><li> नोट सभी मानव संभावित संक्रामक है और सभी प्रक्रियाओं को एक द्वितीय श्रेणी लैिमनार फ्लो कैबिनेट में आयोजित किया जाना चाहिए सामग्री के रूप में व्यवहार किया जाना चाहिए. बाँझ कै?...

<ol>
	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, क्योंकि हम एक मानव ऊतकों कि डिटर्जेंट जैसे जहरीले रसायनों से मुक्त किया गया था से निकालने उत्पन्न करना चाहता था. विशेष रूप से हम इसे इस्तेमाल किया है मानव ऊतक के निष्कर?...

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियां </td></tr><tr><td> 5 मिलीग्राम 12 x 75 मिमी बाँझ polystyrene ट्यूबों </td><td> BD फाल्कन </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> ट्यूबों polystyrene ट्यूबों के लिए कैप्स (ऊपर) </td><td> BD फाल्कन </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml बाँझ ट्यूबों </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> मिथाइल सायनाइड, एक पदार्थ जो तीन या अधिक सिगरेट रोज पीने वाले व्यक्तियों के मूत्र में अधिक मात्रा में पाया जाता है </td><td> Mallinckradt रसायन </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-राजभाषा </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> 537,993 आईएल </td><td></td></tr><tr><td> Homogenizer: PRO200 </td><td> जैव रणनीति </td><td> 01-01200 </td><td> 10 x 115 मिमी जनरेटर देखा - दाँत </td></tr><tr><td> Lyophilizer </td><td></td><td></td><td> VirTis, Benchtop 4K </td></tr><tr><td> बाँझ सुई 18-20 गेज </td><td> Becton Dickinson </td><td> 302032 रेफरी </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 मध्यम </td><td> सिग्मा </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> पीबीएस </td><td> सिग्मा </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> तालिका 1 विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरण.

extraction of tissue antigens for functional assays

अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रतिजन लक्ष्य, बी और टी कोशिकाओं द्वारा मान्यता प्राप्त है, के कई 1 परिभाषित नहीं किया गया है. यह autoimmune रोग और कैंसर 2 में विशेष रूप से सच है. हमारा उद्देश्य autoimmune रोग प्रकार 1 मधुमेह 1,3,4,5 में मानव टी कोशिकाओं द्वारा मान्यता प्राप्त प्रतिजनों की जांच करने के लिए है. ऊतक जहां प्रतिजनों टी कोशिकाओं द्वारा मान्यता प्राप्त नहीं की पहचान कर रहे हैं के खिलाफ मानव टी सेल प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए हम एक प्रारूप कि कार्यात्मक 6 assays के साथ संगत है में मानव ऊतकों से प्रोटीन प्रतिजनों को निकालने के लिए एक विधि विकसित की है. Unpurified ऊतक के अर्क के लिए पहले, टी सेल प्रतिक्रिया क्योंकि निष्कर्षण तरीकों एक lysate कि डिटर्जेंट कि मानव परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं को विषाक्त थे निहित उपज नहीं मापा जा सकता है. यहाँ हम एक स्वरूप है कि मानव टी कोशिकाओं को विषाक्त नहीं है में मानव ऊतकों से प्रोटीन निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. ऊतक Butan-1-राजभाषा acetonitrile, और वाट के एक मिश्रण में homogenized हैएर (Baw). ऊतक निकालने में प्रोटीन एकाग्रता मापा जाता है और प्रोटीन का एक ज्ञात ट्यूबों में बड़े पैमाने पर aliquoted है. निकासी के बाद, कार्बनिक सॉल्वैंट्स lyophilization से हटा रहे हैं. Lyophilized ऊतक के अर्क जब तक आवश्यक संग्रहीत किया जा सकता है. प्रतिरक्षा समारोह, प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक निलंबन assays में उपयोग के लिए उपयुक्त संस्कृति मीडिया में, lyophilized निकालने के लिए किया जा सीधे जोड़ा जा सकता है. Cytokine उत्पादन और PBMC द्वारा प्रसार, इस पद्धति का उपयोग करके तैयार अर्क के जवाब में, आसानी से मापा गया. इसलिए, हमारे विधि मानव ऊतकों lysates कि टी सेल प्रतिक्रिया के विश्लेषण में प्रतिजनों के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है तेजी से तैयारी की अनुमति देता है. हमारा सुझाव है कि इस विधि प्रत्यारोपण, कैंसर और autoimmunity में ऊतकों को अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विश्लेषण की सुविधा होगी.

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Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

मानव ऊतक के निष्कर्षों के लिए कार्यात्मक टी सेल assays में एंटीजन का एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा तैयार करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल में वर्णित है. इस विधि ऊतक व्युत्पन्न प्रतिजनों के लिए टी सेल प्रतिक्रिया मापा जा करने की अनुमति देता है<em&gt; इन विट्रो में</em&gt;.

ऊतक प्रतिजनों के कार्यात्मक assays के लिए निकासी

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

/ प्रकाश अंधेरे चूहे के लिए संक्रमण टेस्ट

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

एफ actin के लिए बाइंडिंग प्रोटीन का विश्लेषण के लिए, actin सह अवसादन परख

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

संरचना lipídic Mesophases का उपयोग कर निर्धारण के लिए झिल्ली प्रोटीन crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

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श्वान - astrocyte का उपयोग सहभागिता के विश्लेषण इन विट्रो में Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

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भेषज और कार्यात्मक जेनेटिक Assays Planarian की पुनर्जनन में हेरफेर करने के लिए बिही Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

पता लगाने मेंढक शुक्राणु Chemoattraction के लिए दो Assays के प्रकार

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases में उच्च throughput झिल्ली प्रोटीन का Crystallization के लिए एक रोबोट का प्रयोग

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Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

जीन अभिव्यक्ति मशीनरी की कार्यात्मक assays के लिए छोटे पैमाने पर परमाणु अर्क

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Viability Assays for Cells in Culture

संस्कृति में कोशिकाओं के लिए व्यवहार्यता Assays

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

अलगाव और संवर्धित कोशिकाओं और माउस के ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया के कार्यात्मक विश्लेषण

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...