Name: extraction of tissue antigens for functional assays
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

Questo lavoro è supportato da sovvenzioni dal Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) e la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) e il progetto di infrastruttura operativa del Governo del Victoria. Ringraziamo i membri del Team Tom Mandel Islet Programma di trapianto di isole di isolamento per fornire i tessuti umani. I tessuti umani sono stati raccolti ed utilizzati con il locale approvazione etica (St. Vincent Hospital HREC-A 011/04 e Salute San Vincenzo HREC-A 135/08).

1. Preparazione del tessuto Spleen <ol><li> Nota-tutto il materiale umana dovrebbero essere considerati come potenzialmente infettivi e le procedure devono essere condotte in una cabina a flusso laminare di classe II. Utilizzando forbici sterili e pinze, rimuovere il tessuto grasso e fibroso dalle sezioni milza (~ 1-2 cm di dimensione) e tagliare la maggior quantità di materiale capsula esterna possibile. </li><li> Tagliare un pezzo di piccole dimensioni (1-2 cm 3) del tessuto della milza e posizionare ogn...

<ol>
	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

Questo protocollo è stato sviluppato perché volevamo per generare un estratto dal tessuto umano che è stato esente da sostanze chimiche tossiche come i detersivi. Specificamente abbiamo utilizzato per preparare estratti di tessuto umano che possono essere utilizzati in saggi di funzione immunitaria umana in vitro. Estratti preparati usando questo protocollo può ugualmente essere ricostituito in qualsiasi buffer e usato per molte analisi biochimiche, quali la cromatografia in western blotting o liquido. Ciò...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 5 ml 12 provette da 75 mm di polistirene sterili </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> Tappi per provette di polistirene tubi (di cui sopra) </td><td> BD Falcon </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> Provette sterili da 50 ml </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> Mallinckradt Chimica </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-olo </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Omogeneizzatore: PRO200 </td><td> Bio-strategia </td><td> 01-01200 </td><td> 10 x 115 mm a dente di sega generatore </td></tr><tr><td> Liofilizzatore </td><td></td><td></td><td> Virtis, da banco 4K </td></tr><tr><td> Sterile aghi calibro 18-20 </td><td> Becton Dickinson </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 Media </td><td> Sigma </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti e attrezzature specifiche.

extraction of tissue antigens for functional assays

Molti degli obiettivi di antigene risposta immunitaria adattativa, riconosciuti da cellule T e B, non sono stati definiti 1. Ciò è particolarmente vero per le malattie autoimmuni e il cancro 2. Il nostro obiettivo è quello di studiare gli antigeni riconosciuti dalle cellule T nel tipo di malattia autoimmune 1 diabete 1,3,4,5. Per analizzare umani risposte delle cellule T contro il tessuto in cui gli antigeni riconosciuti da cellule T non sono identificati abbiamo sviluppato un metodo per estrarre antigeni proteici da tessuto umano in un formato compatibile con saggi funzionali 6. Risposte precedentemente, cellule T ad estratti di tessuto non purificati non potevano essere misurati perché i metodi di estrazione produrre un lisato che conteneva detergenti tossiche per cellule mononucleari del sangue periferico. Qui si descrive un protocollo per estrarre proteine ​​da tessuti umani in un formato che non è tossico per le cellule T umane. Il tessuto è omogeneizzato in una miscela di butan-1-olo, acetonitrile e water (BAW). La concentrazione proteica nel tessuto estratto viene misurato e una massa nota di proteina è frazionato in provette. Dopo l&#39;estrazione, i solventi organici vengono rimossi mediante liofilizzazione. Estratti di tessuti liofilizzati possono essere memorizzati fino al momento. Per l&#39;uso in saggi di funzione immunitaria, una sospensione di cellule del sistema immunitario, in terreni di coltura appropriati, possono essere aggiunti direttamente al estratto liofilizzato. Proliferazione e produzione di citochine da PBMC, in risposta a estratti preparati utilizzando questo metodo, sono stati facilmente misurata. Quindi, il nostro metodo permette la rapida preparazione di lisati di tessuto umano che possono essere utilizzati come fonte di antigeni nell&#39;analisi delle risposte delle cellule T. Suggeriamo che questo metodo faciliterà l&#39;analisi delle risposte immunitarie adattative ai tessuti nei trapianti, cancro e malattie autoimmuni.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Un semplice protocollo per la preparazione di estratti di tessuto umano da utilizzare come fonte di antigeni a cellule T funzionali saggi è descritto. Questo metodo consente risposte delle cellule T al tessuto-antigeni derivati ​​da misurare<em&gt; In vitro</em&gt;.

Estrazione di antigeni dei tessuti per test funzionali

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

Luce / buio test di transizione per i Topi

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Ricerca

Biologia

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

I dosaggi farmacologici genetica e funzionale di manipolare Rigenerazione del Planaria Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Due tipi di saggi per chemiotassi Frog rilevamento sperma

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Estratti nucleari di piccole dimensioni per saggi funzionali di espressione genica Macchinari

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Viability Assays for Cells in Culture

I saggi di redditività per le cellule in coltura

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...