Name: extraction of tissue antigens for functional assays
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00
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この作品は、オーストラリア国立保健医療研究評議会（NHMRC＃559007）と若年性糖尿病研究財団（JDRF 4-2006-1025）とビクトリア州政府の業務インフラスキームからの補助金によってサポートされています。我々は、ヒト組織を提供するためのトムマンデル膵島移植プログラムの膵島分離チームのメンバーに感謝。ヒトの組織は、ローカル倫理承認（聖ビンセント病院HREC-011/04とセント·ビンセント健康HREC-135/08）で収集され、使用されていました。

1。脾臓組織の準備<ol><li>注 - すべての人間の材料は、感染の危険として扱われるべきであり、すべての手続きは、クラスII層流内閣で実施すべきである。滅菌ハサミとピンセットを用いて、脾臓切片（サイズは〜1-2 CM）から脂肪や繊維組織を除去し、可能な限り外側のカプセル材料の限りを切り落とす。 </li><li>脾臓組織の小片（1〜2 cm 3）をカットし、滅菌した50mlファルコンチュー...

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	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

我々はこのような界面活性剤などの有害な化学物質から自由であったヒト組織からの抽出物を生成したかったので、このプロトコルが開発されました。具体的に我々は、in vitroでのヒト免疫機能のアッセイに使用することができるヒト組織の抽出物を調製し、それを使用している。このプロトコルを使用して調製した抽出液を均等に任意のバッファで再構成し、そのようなウェスタン?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 5ミリリットル12×75ミリメートル無菌ポリスチレンチューブ</td><td> BDファルコン</td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td>チューブのポリスチレンチューブ用キャップ（上） </td><td> BDファルコン</td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ミリリットル滅菌チューブ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td> Mallinckradtケミカル</td><td> 2856から10 </td><td></td></tr><tr><td>ブタン-1 - オール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー：PRO200 </td><td>バイオ戦略</td><td> 01-01200 </td><td> 10×115ミリメートルのこぎりジェネレータ</td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td></td><td></td><td> VIRTIS、ベンチ4K </td></tr><tr><td>滅菌針18から20ゲージ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066ミディアム</td><td>シグマ</td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td>シグマ</td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1に特異的な試薬や機器。

extraction of tissue antigens for functional assays

A、BおよびT細胞によって認識される、適応免疫応答の抗原標的の多くは1に定義されていない。これは、自己免疫疾患や癌2に特に当てはまります。私たちの目的は、自己免疫疾患の1型糖尿病1,3,4,5にヒトT細胞により認識される抗原を調べることである。 T細胞によって認識される抗原が同定されていない組織に対してヒトT細胞応答を分析するために、我々は機能的アッセイ6と互換性のあるフォーマットでヒト組織からタンパク質抗原を抽出する手法を開発しました。抽出方法は、ヒト末梢血単核細胞に有毒であった洗剤が含まれていることをライセートをもたらすので、以前は、未精製の組織抽出物に対するT細胞応答を測定することができなかった。ここでは、ヒトT細胞に有毒ではない形式でヒト組織からタンパク質を抽出するためのプロトコルを記述します。組織はブタン-1 - オール、アセトニトリル、ワットの混合物中で均質化されるER（BAW）。組織抽出液中のタンパク質濃度が測定され、タンパク質の既知の質量をチューブに等分されています。抽出後、有機溶媒は凍結乾燥によって除去される。必要になるまで凍結乾燥組織抽出物を保存することができます。免疫機能、免疫細胞の懸濁液のアッセイに使用するためには、適切な培養培地中で、凍結乾燥した抽出液に直接添加することができる。 PBMCによるサイトカイン産生と増殖は、この方法を用いて調製した抽出物に応じて、容易に測定した。したがって、我々の方法は、T細胞応答の解析における抗原のソースとして使用することができ、人間の組織ライセートの急速な製造を可能にする。我々は、この方法は移植、がんや自己免疫の組織への適応免疫応答の解析を容易にするであろうことを示唆している。

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Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

機能的なT細胞アッセイにおける抗原のソースとして使用するヒト組織の抽出物を調製するための単純なプロトコルが記載されている。この方法は、組織由来の抗原に対するT細胞の反応を測定することができる<em&gt; in vitroで</em&gt;。

機能アッセイのための組織抗原の抽出

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

マウス用ダーク/ライト遷移テスト

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

アクチン共沈降アッセイ、F -アクチンへの結合タンパク質の解析のための

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

使用シュワン-アストロサイト相互作用の解析インビトロアッセイ

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

プラナリアの再生を操作するために薬理学的および機能的遺伝学的アッセイ<emジャポニカ> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

カエル精子の化学誘引を検出するためのアッセイの二種類

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

遺伝子発現用機械の機能的アッセイのための小規模の核抽出物

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Viability Assays for Cells in Culture

培養中の細胞のための生存率アッセイ

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...