Name: extraction of tissue antigens for functional assays
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00
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이 작품은 호주 국립 보건 의학 연구위원회 (NHMRC # 559007) 및 아동 당뇨병 연구 재단 (JDRF 4-2006-1025)와 빅토리아 정부의 운영 인프라 계획의 보조금에 의해 지원됩니다. 우리는 인간의 조직을 제공하는 톰 Mandel 작은 섬 이식 프로그램 작은 섬 절연 팀의 구성원을 감사드립니다. 인간의 조직이 지역의 윤리적 승인을 수집하여 사용되었다 (세인트 빈센트 병원 HREC-A 011 / 04, 세인트 빈센트의 건강 HREC-A 135 / 08).

1. 비장 조직을 준비 <ol><li> 참고 - 모든 인간 자료는 잠재적으로 전염성이 모든 절차는 클래스 II의 층류 내각에서 실시되어야한다로 취급해야합니다. 멸균 가위와 집게를 사용하여, 비장 섹션 (크기 ~ 1~2센티미터)에서 지방과 섬유 조직을 제거하고 가능한 한 바깥 쪽 캡슐 소재의 많은을 잘라. </li><li> 비장 조직의 작은 조각 (1~2센티미터 3) 잘라 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 각각의 조각을 배치?...

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	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

우리는 이러한 세제 등 독성 화학 물질에서 자유를 인간의 조직에서 추출을 생성 싶었 기 때문이 프로토콜은 개발되었습니다. 특히 우리는 체외에서 인간의 면역 기능의 assays에서 사용할 수있는 인체 조직의 추출물을 준비하는 데 사용했습니다. 이 프로토콜을 사용하여 준비 추출물은 똑같이 버퍼에 재구성 및 blotting 서쪽이나 액체 크로마토 그래피 등 여러 생화학 분석, 사용할 수 있습니...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 5 ML 12 X 75mm 멸균 폴리스티렌 튜브 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> 튜브의 폴리스티렌 튜브에 캡 (위) </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml 멸균 튜브 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 아세토 니트릴 </td><td> Mallinckradt 화학 </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-좋았어요 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> 균질 : PRO200 </td><td> 바이오 전략 </td><td> 01-01200 </td><td> 10 × 115mm 톱니 생성기 </td></tr><tr><td> Lyophilizer </td><td></td><td></td><td> Virtis, Benchtop 4K </td></tr><tr><td> 멸균 니들 18-20 게이지 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> REF 302,032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 매체 </td><td> 시그마 </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> 시그마 </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 특정 시약 및 장비.

extraction of tissue antigens for functional assays

B와 T 세포에 의해 인식 적응 면역 반응의 항원 대상, 대부분은 1 정의되지 않았습니다. 이 면역 질환과 암 2 특히 사실입니다. 우리의 목적은 면역 질병 1 형 당뇨병 1,3,4,5 인간의 T 세포에 의해 인식 항원을 조사하는 것입니다. T 세포에 의해 인식 항원이 발견되지 않는 조직에 대한 인간 T-세포 반응을 분석하기 위해 우리는 기능 assays 6 호환되는 형식으로 인간의 조직에서 단백질 항원을 추출하는 방법을 개발했습니다. 추출 방법은 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포에 독성했다 세제를 포함하는 lysate를 얻을 수 있기 때문에 unpurified 조직 추출물로 이전, T-세포 반응을 측정 할 수 없습니다. 여기 인간의 T 세포에 독성이없는 형식으로 인간의 조직에서 단백질을 추출하기위한 프로토콜을 설명합니다. 조직은 butan-1-안녕, 아세토 니트릴 및 와트의 혼합물에 균질하고 있습니다어 (BAW). 조직 추출물의 단백질 농도는 측정 및 단백질의 알려진 질량은 튜브에 aliquoted 있습니다. 추출 후, 유기 용제는 lyophilization에 의해 제거됩니다. 필요 할 때까지 동결 건조 된 조직 추출물은 저장 될 수 있습니다. 면역 기능, 면역 세포의 정지 assays에 사용하기 위해, 적절한 문화 미디어, 동결 건조 추출물에 직접 추가 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 준비 추출물에 대한 응답으로 PBMC의 시토 킨 생산 및 확산은, 쉽게 측정 하였다. 따라서, 우리의 방법은 T-세포 반응의 분석에서 항원의 소스로 사용할 수있는 인간의 조직 lysates의 급속한 준비를 할 수 있습니다. 이 방법은 이식, 암과 autoimmunity의 조직에 적응 면역 반응의 분석을 용이하게 할 것을 권장합니다.

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Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

기능 T-세포 assays에서 항원의 소스로 사용되는 인체 조직의 추출물을 준비하기위한 간단한 프로토콜은 설명되어 있습니다. 이 방법은 조직 유래 항원에 대한 T 세포 반응을 측정 할 수 있습니다<em&gt; 체외에서</em&gt;.

기능 Assays을위한 조직 항원의 추출

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

마우스에 대한 진한 / 라이트 전환 테스트

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

연구

생물학

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

사용 Schwann - astrocyte 상호 작용 분석 체외에서 Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

약리 및 기능성 유전자 Assays은 Planarian의 재생을 조작하는<em자포니카> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

감지 개구리 정자 Chemoattraction에 대한 Assays 두 종류의

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

유전자 표현 기계의 기능 Assays을위한 소규모 핵 추출물

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Viability Assays for Cells in Culture

문화의 세포에 대한 생존 분석 실험

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...