Name: extraction of tissue antigens for functional assays
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

Dette arbeidet er støttet med tilskudd fra Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) og Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) og Operational Infrastruktur Scheme av den viktorianske regjeringen. Vi takker medlemmene av Tom Mandel Islet Transplantasjon Program Islet Isolation Team for å gi de menneskelige vev. Menneskelig vev ble samlet inn og brukt med lokal etisk godkjenning (St. Vincent Hospital HREC-A 011/04 og St. Vincent er Helse HREC-A 135/08).

1. Forbereder Spleen Tissue <ol><li> Note-all menneskelig materiale bør behandles som potensielt smittefarlige og alle prosedyrer bør gjennomføres i en klasse II Laminar Flow Cabinet. Bruke steril saks og tang, fjerne fett og bindevev fra milt seksjoner (~ 1-2 cm i størrelse) og klippe av så mye av det ytre kapsel materiale som mulig. </li><li> Skjær et lite stykke (1-2 cm 3) av milten vev og plassere hver brikke i et sterilt 50 ml Falcon-rør. </li><li> Snap-fryse biter av vev ved nedsenkning i flyte...

<ol>
	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

Denne protokollen ble utviklet fordi vi ønsket å generere et utdrag fra menneskelig vev som var fri for giftige kjemikalier som vaskemidler. Spesifikt vi har brukt det å forberede ekstrakter av menneskelig vev som kan brukes i analyser av humant immun funksjon in vitro. Ekstrakter fremstilt ved hjelp av denne protokollen kan likeledes rekonstitueres i enhver buffer og brukes for mange biokjemiske analyser, som Western blotting eller væskekromatografi. Dette gjør denne teknikken som gjelder for mange nedstr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyren rør </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> Lokker på rør polystyren rør (ovenfor) </td><td> BD Falcon </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml sterile rør </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> Mallinckradt Kjemikalier </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-ol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homogenisator: PRO200 </td><td> Bio-strategi </td><td> 01-01200 </td><td> 10 x 115 mm sagtann generator </td></tr><tr><td> Lyophilizer </td><td></td><td></td><td> Virtis, Benkeplate 4K </td></tr><tr><td> Steril nål 18-20 måle </td><td> Becton Dickinson </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 Medium </td><td> Sigma </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Spesifikke reagenser og utstyr.

extraction of tissue antigens for functional assays

Mange av antigenet målene for adaptiv immunrespons, anerkjent av B-og T-celler, er ikke blitt definert 1. Dette gjelder særlig i autoimmune sykdommer og kreft to. Vårt mål er å undersøke antigener anerkjent av humane T-celler i autoimmune sykdom type 1 diabetes 1,3,4,5. Å analysere humane T-celle responser mot vev der antigener gjenkjent av T-celler er ikke identifisert vi utviklet en metode for å utvinne protein antigener fra humant vev i et format som er kompatibelt med funksjonelle analyser 6. Tidligere, T-celle responser på urenset vev ekstrakter kunne ikke måles fordi hentingsmetodene gi et lysat som inneholdt vaskemidler toksiske for humane perifere mononukleære blodceller. Her beskriver vi en protokoll for å trekke proteiner fra menneskelig vev i et format som ikke er giftig for humane T-celler. Vevet homogeniseres i en blanding av butan-1-ol, acetonitril og watER (BAW). Proteinkonsentrasjonen i vevekstrakt måles og en kjent masse av protein er alikvoteres inn rør. Etter ekstraksjon, blir de organiske løsningsmidler fjernet ved lyofilisering. Lyofiliserte vev ekstrakter kan lagres inntil nødvendig. For bruk i analyser av immunfunksjonen, en suspensjon av immunceller, i hensiktsmessige dyrkningsmedier, kan legges direkte på den lyofiliserte ekstrakt. Cytokin produksjon og proliferasjon av PBMC, som svar på ekstrakter fremstilt ved hjelp av denne metoden, ble lett målt. Derfor tillater vår metode den raske fremstilling av humane vev lysater som kan brukes som en kilde for antigener i analysen av T-celle responser. Vi foreslår at denne metoden vil lette analysen av adaptive immunresponser mot vev i transplantasjon, kreft og autoimmunitet.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

En enkel protokoll for fremstilling ekstrakter av menneskelig vev som skal brukes som en kilde for antigener i funksjonelle T-celle-analyser er beskrevet. Denne metoden tillater T-celle responser på vev-avledede antigener skal måles<em&gt; In vitro</em&gt;.

Utvinning av Tissue Antigener for Funksjonell Assays

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

To typer analyser for Oppdage Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Bruk av en robot for High-throughput Krystallisering av membran proteiner i Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Småskala Nuclear Ekstrakter til Funksjonelle analyser av Gene-uttrykk Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Viability Assays for Cells in Culture

Levedyktighet Analyser for celler i kultur

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolasjon og Funksjonell analyse av Mitokondrier fra dyrkede celler og mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...