Name: extraction of tissue antigens for functional assays
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00
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Este trabalho é apoiado por concessões do Australian Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho (NHMRC # 559007) eo Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) e do Sistema de Infra-estrutura Operacional do Governo de Victoria. Agradecemos aos membros da Islet Mandel Tom Programa de Transplante Equipe Isolamento Islet para a prestação dos tecidos humanos. Tecidos humanos foram coletadas e utilizadas com aprovação ética local (Hospital São Vicente HREC-A 011/04 e de Saúde de São Vicente HREC-A 135/08).

1. Preparando tecido do baço <ol><li> Nota-todo o material humano devem ser tratados como potencialmente infecciosos e todos os procedimentos devem ser realizados em uma Capela Fluxo Laminar Classe II. Usando tesouras e pinças esterilizadas, remover gordura e tecido fibroso de seções do baço (~ 1-2 cm de tamanho) e retire o máximo de material da cápsula externa possível. </li><li> Corte um pedaço pequeno (1-2 cm 3) de tecido do baço e colocar cada peça em um tubo de 50 ml estéril Falcon. </li><l...

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	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

Este protocolo foi desenvolvido porque queríamos gerar um extrato de tecido humano que estava livre de produtos químicos tóxicos como detergentes. Especificamente utilizou-se para preparar os extractos de tecido humano que podem ser utilizados em ensaios de função imunitária humana, in vitro. Extractos preparados utilizando este protocolo pode igualmente ser reconstituída em qualquer tampão e usados ​​para muitas análises bioquímicas, tais como cromatografia de Western blotting ou líquid...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 5 ml 12 x 75 mm tubos de polistireno estéreis </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> Tampas para tubos de tubos de poliestireno (acima) </td><td> BD Falcon </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml tubos estéreis </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrila </td><td> Chemicals Mallinckradt </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-ol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homogeneizador: PRO200 </td><td> Bio-estratégia </td><td> 01-01200 </td><td> 10 x 115 mm gerador de dente de serra </td></tr><tr><td> Liofilizador </td><td></td><td></td><td> Virtis, bancada 4K </td></tr><tr><td> Agulha estéril calibre 18-20 </td><td> Becton Dickinson </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 Meio </td><td> Sigma </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes específicos e de equipamento.

extraction of tissue antigens for functional assays

Muitos dos alvos de antigénio de resposta imune adaptativa, reconhecidos por células T e B, não foram definidas 1. Isto é particularmente verdadeiro em doenças auto-imunes e cancro 2. O nosso objectivo é o de investigar os antigénios reconhecidos pelas células T humanas do tipo de doença auto-imune uma diabetes 1,3,4,5. Para a análise de células T humanas respostas contra o tecido, onde os antigénios reconhecidos pelas células T são identificadas não foi desenvolvido um método para extrair os antigénios de proteína a partir de tecido humano, em um formato que é compatível com ensaios funcionais 6. Respostas previamente, de células T para extractos de tecido não purificados não puderam ser medidos por métodos de extracção de produzir um lisado que continha detergentes que foram tóxicas para as células mononucleares do sangue periférico. Aqui descrevemos um protocolo para a extracção de proteínas a partir de tecidos humanos, em um formato que não é tóxico para as células T humanas. O tecido é homogeneizado numa mistura de butan-1-ol, acetonitrilo e water (BAW). A concentração de proteína no extracto de tecido é medida e uma massa conhecida de proteína é separado em alíquotas para tubos. Depois da extracção, os solventes orgânicos são removidos por meio de liofilização. Extractos de tecidos liofilizados podem ser armazenados até serem necessários. Para utilização em ensaios da função imune, uma suspensão de células do sistema imunológico, em meios de cultura apropriados, podem ser adicionados directamente ao extracto liofilizado. A produção de citocinas e a proliferação de PBMC em resposta a extractos preparados utilizando este método, foram facilmente medido. Por isso, o nosso método permite a preparação rápida de lisados ​​de tecido humano que podem ser utilizados como uma fonte de antigénios na análise de respostas de células T. Sugerimos que este método irá facilitar a análise das respostas imunes adaptativas para os tecidos em transplantes, cancro e auto-imunidade.

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Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Um protocolo simples para a preparação de extractos de tecido humano para ser usado como uma fonte de antigénios de células T funcionais de ensaios está descrito. Este método permite a respostas das células T aos antigénios derivados de tecido a ser medido<em&gt; In vitro</em&gt;.

Extracção do Tissue Antigens para Ensaios Funcionais

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

Claro / escuro Teste de transição para Ratos

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Biologia

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Análise de Schwann-astrócito Interações Usando In Vitro Ensaios

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Farmacológica e funcional Ensaios genética para manipular Regeneração da planária Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Dois tipos de ensaios para detecção de quimiotaxia Sapo Sperm

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Os pequenos extratos nucleares para ensaios funcionais da expressão gênica Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Viability Assays for Cells in Culture

Ensaios de viabilidade para células em cultura

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...