Name: extraction of tissue antigens for functional assays
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

Работа выполнена при поддержке грантов от Австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC # 559007) и детского диабета исследовательский фонд (JDRF 4-2006-1025) и схема работы инфраструктуры правительства штата Виктория. Мы благодарим членов Tom Mandel трансплантации островков Программа Команда изоляции островок для обеспечения тканей человека. Ткани человека были собраны и использованы с местными этические утверждения (больница Святого Винсента HREC-A 011/04 и здоровью Сент-Винсент HREC-A 135/08).

1. Подготовка ткани селезенки <ol><li> Обратите внимание, все человеческий материал следует рассматривать как потенциально инфицированные и все процедуры должны проводиться в ламинарном класса Кабинета потока II. Используя стерильные ножницы и пинцет, удаления жира и волокнистой ткани с...

<ol>
	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

Этот протокол был разработан, потому что мы хотели создать выписку из тканей человека, которая была свободна от токсичных химических веществ, таких как моющие средства. В частности, мы использовали его для подготовки экстрактов тканей человека, которые могут быть использованы в анализ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> 5 мл 12 х 75 мм, стерильные пробирки из полистирола </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> Колпачки для труб Трубы полистирола (см. выше) </td><td> BD Falcon </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50 мл стерильные пробирки </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Ацетонитрил </td><td> Mallinckradt химических веществ </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Бутан-1-ол </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Гомогенизатор: PRO200 </td><td> Bio-стратегии </td><td> 01-01200 </td><td> 10 х 115 мм пилообразный генератор </td></tr><tr><td> Лиофилизатор </td><td></td><td></td><td> Virtis, настольная 4K </td></tr><tr><td> Стерильных игл 18-20 калибровочных </td><td> Becton Dickinson </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 Средние </td><td> Сигма </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Сигма </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> Таблица 1. Специфических реагентов и оборудования.

extraction of tissue antigens for functional assays

Многие из антигена целей адаптивного иммунного ответа, признанного B и Т-клетки, которые не были определены 1. Это особенно актуально при аутоиммунных и онкологических заболеваний 2. Нашей целью является исследование антигенов признан человеческий Т-клеток в аутоиммунных болезней типа диабета 1 1,3,4,5. Для анализа человеческого Т-клеточного ответа против ткани, где антигенов признан Т-клетки не выявлены мы разработали метод извлечения белковых антигенов от человеческих тканей в формат, совместимый с функциональными анализы 6. Ранее, Т-клеточный ответ на неочищенных экстрактах ткани не может быть измерено, потому что добыча методы дают лизат, содержащий моющие средства, которые были токсичными для человека мононуклеарных клеток периферической крови. Здесь мы опишем протокол для извлечения белков из тканей человека в формате, который не является токсичным для человеческого Т-клеток. Ткани гомогенизируют в смеси бутан-1-ол, ацетонитрил и Ватэр (BAW). Концентрация белка в тканях экстракта измеряют и известная масса белка аликвоты в пробирки. После извлечения органических растворителей удаляются путем лиофилизации. Лиофилизированный экстракт ткани могут храниться до необходимости. Для использования в анализах функции иммунной системы, подвески иммунных клеток, в соответствующих средствах массовой информации культуре, может быть добавлена ​​непосредственно в лиофилизированного экстракта. Производство цитокинов и пролиферацию PBMC в ответ на экстракты, приготовленные с помощью этого метода, было легко измерить. Таким образом, наш метод позволяет быстро подготовка человека лизатов ткани, которые могут быть использованы в качестве источника антигенов в анализе Т-клеточного ответа. Мы полагаем, что этот метод будет способствовать анализ адаптивного иммунного ответа тканей при трансплантации, рак и аутоиммунные заболевания.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Простой протокол для подготовки экстрактов тканей человека для использования в качестве источника антигенов в функциональных Т-клеточных анализов описаны. Этот метод позволяет Т-клеточный ответ на ткани антигенов для измерения<em&gt; В пробирке</em&gt;.

Добыча тканевых антигенов для функциональных анализов

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

Свет / темно Переход Тест для мышей

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Актина сотрудничества седиментации Пробирной; для анализа связывание белка с F-актин

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Кристаллизующихся мембранных белков для определения структуры использования липидный Мезофазы

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Анализ Шванн-астроцитов взаимодействий с использованием In Vitro Анализы

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Фармакологические и функциональные Генетические анализы манипулировать Регенерация планарии Dugesia японская</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Два типа Анализы для обнаружения Chemoattraction спермы лягушки

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Использование робота для высокой пропускной кристаллизации мембранных белков в липидный Мезофазы

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Малая ядерная Экстракты для функционального анализов экспрессии генов Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Viability Assays for Cells in Culture

Жизнеспособность Анализы на клетки в культуре

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Выделение и функциональный анализ митохондрий из культивируемых клеток и мышь ткани

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...