Name: extraction of tissue antigens for functional assays
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

Detta arbete stöds av bidrag från Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559.007) och Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) och det operativa infrastruktur systematiken i viktorianska regeringen. Vi tackar medlemmarna i Tom Mandel Islet Transplantation Program Islet Isolation Team för att tillhandahålla de mänskliga vävnader. Mänskliga vävnader samlas in och används med lokala etiska godkännanden (Saint Vincent Sjukhus HREC-A 011/04 och St Vincent Health HREC-A 135/08).

1. Förbereda mjältvävnad <ol><li> Obs-all mänskligt material skall behandlas som potentiellt infektiösa och alla förfaranden bör genomföras på ett klass II skåp med laminärt flöde. Användning av sterila saxar och pincetter, ta bort fett och fibrös vävnad från mjälte sektioner (~ 1-2 cm i storlek) och trimma bort så mycket av den yttre kapseln materialet som möjligt. </li><li> Skär en liten bit (1-2 cm 3) i mjältvävnad och placera varje del i en steril 50 ml Falcon-rör. </li><li> Snäp...

<ol>
	<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes.">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li><li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation.">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li><li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+CD4++T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes.">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4++T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes.">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified.">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li><li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays.">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy,+Pre-diabetic,+and+Diabetic+Donors.">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li><li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide.">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li><li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+preparations+of+GAD65,+proinsulin,+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes:+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes.">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li><li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation.">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li></ol>

Detta protokoll har utvecklats för att vi ville skapa ett utdrag ur mänsklig vävnad som var fri från giftiga kemikalier, såsom rengöringsmedel. Specifikt har vi använt den för att bereda extrakt av mänsklig vävnad som kan användas i analyser av mänsklig immunförsvar in vitro. Extrakt framställda med användning av detta protokoll kan likaledes rekonstitueras i en buffert och användas för många biokemiska analyser, såsom Western blotting eller vätskekromatografi. Detta gör denna teknik tillä...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 5 ml 12 x 75 mm sterila polystyrenrör </td><td> BD Falcon </td><td> 352.054 </td><td></td></tr><tr><td> Lock för rör polystyrenrör (ovan) </td><td> BD Falcon </td><td> 352.032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml sterila rör </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352.070 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> Mallinckradt Kemikalier </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-ol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 537.993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homogenisator: PRO200 </td><td> Bio-strategi </td><td> 01-01200 </td><td> 10 x 115 mm sågtandade generator </td></tr><tr><td> Lyofilisator </td><td></td><td></td><td> Virtis, bänk 4K </td></tr><tr><td> Steril nål 18-20 gauge </td><td> Becton Dickinson </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 medium </td><td> Sigma </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Specifika reagens och utrustning.

extraction of tissue antigens for functional assays

Många av antigen mål adaptiva immunsvaret, som erkänns av B-och T-celler, har inte definierats 1. Detta är särskilt sant i autoimmuna sjukdomar och cancer 2. Vårt mål är att undersöka de antigener känns igen av humana T-celler i den autoimmuna sjukdomen typ 1-diabetes 1,3,4,5. För att analysera humana T-cellsvar mot vävnaden där de antigener som känns igen av T-celler inte är identifierade vi utvecklat en metod för att extrahera proteinantigener från mänsklig vävnad i ett format som är kompatibelt med funktionella analyser 6. Tidigare, T-cell-svar på orenade vävnadsextrakt kunde inte mätas eftersom extraktionsmetoder ger ett lysat som innehöll detergenter som var toxiska för humana perifera blodmononukleära celler. Här beskriver vi ett protokoll för att extrahera proteiner från mänskliga vävnader i ett format som inte är giftigt för humana T-celler. Vävnaden homogeniseras i en blandning av butan-1-ol, acetonitril och WatER (BAW). Proteinkoncentrationen i vävnaden extraktet mäts och en känd massa av protein alikvoterades i tuber. Efter extraktion, de organiska lösningsmedlen avlägsnades genom lyofilisering. Lyofiliserade vävnadsextrakt kan lagras tills den behövs. För användning i analyser av immunfunktion, en suspension av immunceller, i lämpliga odlingsmedier, kan tillsättas direkt till den lyofiliserade extraktet. Cytokinproduktion och proliferation genom PBMC som svar på extrakt framställda med denna metod, var lätt mätas. Följaktligen, tillåter vår metod snabb framställning av mänsklig vävnad lysat som kan användas som en källa för antigener i analysen av T-cellsvar. Vi föreslår att denna metod kommer att underlätta analysen av adaptiva immunsvar till vävnader vid transplantation, cancer och autoimmunitet.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays at JoVE.com

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Ett enkelt protokoll för framställning extrakt av mänsklig vävnad som skall användas som en källa för antigener i funktionella T-cell-analyser beskrives. Denna metod tillåter T-cellsvar mot vävnads-härledda antigener som skall mätas<em&gt; In vitro</em&gt;.

Extraktion av Tissue Antigens för Funktionella analyser

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

Ljus / mörk Transition Test för möss

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliserande Membrane proteiner för strukturbestämning med Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analys av Schwann-astrocyternas interaktioner Använda In Vitro Analyser

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Farmakologiska och funktionella genetiska analyser för att manipulera Regenerering av Planarian Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Två typer av analyser för att upptäcka Frog spermier Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Användning av en robot för hög kapacitet Kristallisering av membranproteiner i lipidisk mesofaser

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Småskaliga nukleärextrakt för funktionella analyser av genuttryck maskinerier

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Viability Assays for Cells in Culture

Bärkraft: Analyser för celler i odling

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering och Funktionell analys av mitokondrier från odlade celler och mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...