Name: bridging the bio-electronic interface with biofabrication
Uploaded: 2012-06-06T13:00:00
Duration: 16 min 38 s
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Nous reconnaissons le financement de DTRA pour le soutien de ce manuscrit et de l&#39;ONR, DTRA, et la NSF pour le soutien partielle de la recherche sous-jacente.

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	<li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+generation+of+pH+gradients+in+microfluidic+devices+for+biofabrication+of+freestanding,+semi-permeable+chitosan+membranes.">In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes.</a> Lab Chip. 10, 59-65 (2010).</li><li>Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Activated+Ionic+Gelation+of+Common+Biopolymers.">Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers.</a> Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).</li><li>Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. 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M., Elibol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+as+an+immobilization+material+for+MAb+production+via+encapsulated+hybridoma+cells.">Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).</li><li>Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentle+cell+trapping+and+release+on+a+microfluidic+chip+by+in+situ+alginate+hydrogel+formation.">Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation.</a> Lab Chip. 5, 553-559 (2005).</li><li>Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Film+Bioprocessing+and+Immunoanalysis+with+Electroaddressable+Stimuli-Responsive+Polysaccharides.">In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides.</a> Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).</li><li>Cheong, M., Zhitomirsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrodeposition+of+alginic+acid+and+composite+films.">Electrodeposition of alginic acid and composite films.</a> Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).</li><li>Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+induction+of+recombinant+proteins+by+minimally+rewiring+native+quorum+sensing+regulon+of+E.+coli.">Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli.</a> Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).</li></ol>

La production et l&#39;accès gratuit à cet article est sponsorisé par l&#39;Agence américaine de défense des États réduction de la menace.

Nos procédures de démontrer l&#39;électrodéposition et la fonctionnalisation des films en biopolymère, un processus que nous appelons biofabrication. Grâce à fonctionnalisation avec des cellules et des biomolécules on crée des surfaces biologiques capables d&#39;interagir les uns avec les autres et l&#39;électrode d&#39;adressage sont assemblés sur. La première étape, l&#39;électrodéposition, a lieu à travers l&#39;auto-assemblage a déclenché des biopolymères, de l&#39;alginate et de chitosane dans nos études, en réponse à un signal électrique. Comme indiqué précédemment un gradient de pH est généré qui peut être commandé par la densité de courant et le temps de dépôt, fournir un contrôle supplémentaire sur les dimensions des films et des propriétés 6,17. Nous avons trouvé qu&#39;une variété de densité de courant et les combinaisons de temps de dépôt peut être utilisé pour les électrodes indiquées dans le tableau 1. Bien que l&#39;utilisation d&#39;autres électrodes est possible, des ajustements à la procédure serait nécessaire. En comparaison avec d&#39;autres techniques de formation d&#39;un film sur le processus de electrodeposition est simple, rapide et réactif,. Il n&#39;y a pas besoin d&#39;un vaste répertoire de matériel coûteux et des préparations laborieuses. Surtout, le processus peut résister à des écarts mineurs expérimentales et peut être facilement commencé plus si un problème survient. Le chitosane est capable de répondre à un gradient de pH cathodique élevé en raison de propriétés fonctionnelles importantes qui lui sont conférées par une teneur élevée des amines primaires. À un pH élevé (supérieur à son pKa de 6,3 ~) les amines sont déprotoné et le chitosane devient insoluble, ce qui permet la formation du film. Après dépôt, les films resteront attachés à l&#39;électrode. Toutefois, la capacité existe pour les décoller si vous le souhaitez. Les films reste stable aussi longtemps que le pH de la solution ne chute pas en dessous du pKa. Solutions acides protoner les amines et les répulsions électrostatiques ultérieures gonfler le gel jusqu&#39;à ce qu&#39;il se dissout 18. Autrement dit, le processus de montage / démontage est réversible à la demande et allows pour l&#39;enlèvement des films déposés et la réutilisation des électrodes. Idéalement, la gamme de pH à laquelle la transition sol-gel a lieu est proche de celui dans lequel les composants les plus biologiques fonctionner de manière optimale. Cela rend le processus idéal pour la conservation de la fonctionnalité lors de l&#39;assemblage 6. Formation d&#39;un film d&#39;alginate est facilitée par l&#39;électrolyse anodique de l&#39;eau ainsi que la présence de carbonate de calcium 7. Le pH faible localisée à l&#39;anode solubilise le carbonate de calcium conduisant à des cations calcium libération. Ces ions sont chélaté par l&#39;alginate, formant un réseau réticulé sur la surface d&#39;électrode. Des films d&#39;alginate sont notamment réversible par compétition pour des ions calcium à partir de composés chélatants tels que l&#39;EDTA ou du citrate, qui peuvent être utilisés pour dissoudre les films, permettant la réutilisation des électrodes sous-jacentes. Ainsi, les films d&#39;alginate sont relativement fragiles lorsqu&#39;ils sont soumis à des conditions physiologiques, car les ions calcium sont facilement scavenged de la matrice de gel, ce qui affaiblit sa structure et la promotion du film délamination ou redissolution. Pour surmonter cette limitation, nous avons inclus une étape d&#39;incubation pour le film en 1 M CaCl 2 à renforcer le gel. En outre, nous recommandons que la solution d&#39;incubation du film (milieux cellulaires, etc) être complétée par CaCl 2 à une concentration de 500 uM-3 mM. La procédure deuxième grande est la fonctionnalisation du film déposé avec les composants biologiques. Ceci peut être réalisé de deux façons, la première étant de conjugaison électrochimique, une stratégie qui permet de montage rapide et réactif, avec des protéines de contrôle du territoire exceptionnelle de 10. Cependant, fonctionnalisation de cette manière est limitée par la diffusion de Cl - ions à travers le film à l&#39;électrode ainsi que la diffusion de HOCl, l&#39;réactive générée intermédiaire, retourner dans la solution. La capacité des molécules électrochimiquement actifs afin de transmettreà travers le film permet pour la transduction de signaux chimiques et biologiques dans le facile à lire des signaux électriques 15. Nous avons montré la tyrosinase médiée couplage comme une deuxième stratégie pour la fonctionnalisation enzyme au chitosane, démontré par liaison covalente AI-2 synthase. Cette stratégie permet au processus de fonctionnalisation d&#39;être contrôlée et sélective - dépend d&#39;un réactif spécifique, la tyrosinase, qui agit de façon discriminatoire sur les protéines contenant un tag tyrosine 9. Nous montrons l&#39;utilité et la biocompatibilité des systèmes multi-adresses en reproduisant les voies naturelles sur une puce. D&#39;abord, nous avons organisé deux populations cellulaires (ie &quot;expéditeurs&quot; et &quot;récepteurs&quot;) à des adresses distinctes, et a montré que leur interaction entre les électrodes adjacentes pour fournir AI-2 et de générer une réponse de fluorescence. Ce concept a également été démontrée par Cheng et al. dans une puce 14 microfluidique. Nous avons également imité l&#39;interaction, mais plutôt utiliséune enzyme pour synthétiser IA-2 pour la livraison. De cette manière, une voie de synthèse intracellulaire, AI-2 de synthèse, a été reproduit par le biais biofabrication et fonctionnait beaucoup comme il le ferait dans une solution. Dans les deux cas, l&#39;assemblage de plusieurs adresses présente le défi d&#39;éviter la non-spécifiques de liaison entre les adresses parce que chaque solution de dépôt doit être présenté à la matrice d&#39;électrodes ensemble, même si électrodéposition est uniquement destiné à une seule adresse. Le lavage doux et en profondeur peut révoquer la majorité de la solution résiduelle de non-biaisées électrodes; l&#39;utilisation de l&#39;écoulement dans les canaux microfluidiques peut réduire encore davantage la non-spécificité. En particulier pour l&#39;biofabrication adjacente de chitosane et des adresses d&#39;alginate, il est recommandé le dépôt du film de chitosan première suite de cela avec les étapes biofonctionnalisation, et après cela, l&#39;alginate de dépôt électrolytique. Bien que nous n&#39;avons pas fait ici, nous avons découvert que le blocage du film chitosane avec des protéines inertes (comme milk, BSA, etc) diminue fortement non-spécifiques de liaison de molécules indésirables à la surface aminée de chitosane. Nous avons trouvé une utilité dans l&#39;établissement électrodes à motifs, on retrouve souvent dans les dispositifs BioMEMS, comme les «Blueprints» pour un arrangement complexe de cellules et des biomolécules. Les utilisations de chitosane électrodéposé dans les dispositifs bioMEMS peut aller bien au-delà des exemples cités ici 19. Chitosan peut être déposée sur différentes géométries microscopique, tels que dans des microcanaux et sur ​​des surfaces non planes 20,15. Les films peuvent également être modifiées avec d&#39;autres polymères et une variété de protéines, l&#39;ADN, les nanoparticules, et d&#39;oxydo-réduction des molécules actives pour 21,22,23 de nouvelles propriétés. Dans les dispositifs BioMEMS, films de chitosane ont été utilisés pour la livraison de drogue, la détection de molécules redox et petite, la biocatalyse, et les études de cellules 20,23,24,25. De même, l&#39;alginate est largement utilisé comme une matrice de cellules-piège et a été explorée pour le confinement fluidique réversible depopulations de cellules et dans le film-immunoanalyse 26,27,28. Des films composites pour les applications d&#39;ingénierie tissulaire ont été fabriqués en utilisant électrodéposition alginate, avec des composants tels que l&#39;hydroxyapatite pour implants orthopédiques 29. Dans nos manifestations de biofabrication, nous avons montré à la fois les interactions entre les composantes biologiques et à travers l&#39;interface bio-électronique pour être également applicable, ce qui met en arriver à la perspective de l&#39;intégration de toutes les variétés d&#39;interactions pour une performance sophistiquée dans la transmission du signal sur la puce. En conséquence, biofabrication peut faciliter la fabrication de dispositifs à une réduction des &quot;tailles minimales métrages&quot; en tant que suite directe à l&#39;évolution rapide de la microfabrication, comme souvent motivés par l&#39;électronique grand public. C&#39;est, next-génération d&#39;appareils pourrait en fait inclure des composants biologiques labiles qui offrent ensemble exquis de la nature et les capacités de reconnaissance sur une longueur encore plus petit scales plus artificielles systèmes. Nous envisageons à court terme des applications dans l&#39;instrumentation analytique, les capteurs environnementaux, et même biocompatibles implantables.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de la composante </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Alimentation </td><td> Keithley </td><td> SourceMeter 2400 </td></tr><tr><td> Trois potentiostat électrode </td><td> CH Instruments </td><td> Potentiostat / galvanostatique 600D </td></tr><tr><td> RE-5B Électrode de référence Ag / AgCl avec connecteur flexible </td><td> BASi </td><td> MF-2052 </td></tr><tr><td> Plaquette de silicium revêtu d&#39;or, 500um Si, Cr 12nm, 120nm Au, SiO 2 pour l&#39;isolation </td><td> fabriqués sur mesure </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;oxyde d&#39;indium étain lame de verre enduite, rectangulaire, 8-12 ohms résister à </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 578274 </td></tr><tr><td> Feuille de platine / feuille (0,002 in) </td><td> Chemetals Surepure </td><td> 1897 </td></tr><tr><td> Slim Line Clips 2 Alligator &quot; </td><td> RadioShack </td><td> 270-346 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Multi-Stacking Banana Patch Cord Plug- </td><td> TSElectronic </td><td> B-36-02 B-24-02 </td></tr><tr><td> Kit SYLGARD 184 élastomère de silicone </td><td> Dow Corning </td><td> NC9020938 De Fischer </td></tr><tr><td> Stéréomicroscope Fluorescecence </td><td> Olympe </td><td> MVX10 MacroView </td></tr><tr><td> cellSens standard </td><td> Olympe </td><td> version 1.3 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Électrodéposition et l&#39;équipement de visualisation de fluorescence. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Chitosan, de poids moléculaire moyen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448877 </td></tr><tr><td> Acide chlorhydrique, ARISTAR. ACS, NF, FCC année </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td></tr><tr><td> Hydroxyde de sodium, Solution. 10.00N </td><td>VWR </td><td> VW3247 </td></tr><tr><td> L&#39;acide alginique, sel de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 180947 </td></tr><tr><td> Multifex-MM précipité Carbonate de calcium, des particules 70nm </td><td> Spécialité Minerals Inc </td><td> 100-3630-3 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Chitosan et réactifs solution d&#39;alginate. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Le chlorure de calcium, dihydrate </td><td> JT Baker </td><td> 0504 </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium, certifié Cristallin ACS </td><td> Fischer Scientifique </td><td> S271 </td></tr><tr><td> Phosphate de potassium monobasique, anhydre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> Phosphate de potassium dibasique anhydre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3786 </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Sigma- Aldrich </td><td> P4417 </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Autres composants de la solution et les réactifs tampons. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société / Source </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> La glucose oxydase d&#39;Aspergillus Niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2133 </td></tr><tr><td> La tyrosinase de champignon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3824 </td></tr><tr><td> Bouillon LB, Miller (granulé) </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP9723-2 </td></tr><tr><td> &quot;AI2-synthase» (HGLPT) </td><td> Lab stock 16 </td><td></td></tr><tr><td> W3110 cellules de type sauvage </td><td> Lab Disponible 30 </td><td></td></tr><tr><td> MDAI2 + pCT6-LSRR - amp r + pET- <em&gt; DsRed - kan cellules r </td><td> Lab Disponible 30 </td><td></td></tr><tr><td> FluoroSphères: diamètre 1 micron, Ex / Em: 505/515 </td><td> Invitrogen </td><td> F8765 </td></tr><tr><td> 5 - (et-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex / Em: 525/560 </td><td> Invitrogen </td><td> C-6157 </td></tr><tr><td> DyLight anticorps kit de marquage, 405 </td><td> Thermo Scientific </td><td> PI-53020 </td></tr></tbody></table> Enzymes Tableau 4., De cellules et de réactifs de fonctionnalisation d&#39;autres.

bridging the bio-electronic interface with biofabrication

Les progrès de la technologie de la promesse de laboratoire-sur-une-puce de révolutionner la recherche et la médecine par une baisse des coûts, une meilleure sensibilité, la portabilité et un débit plus élevé. L&#39;incorporation de composants biologiques biologiques sur les systèmes microélectromécaniques (BioMEMS) a montré un grand potentiel pour atteindre ces objectifs. Microfabriqués puces électroniques permettent échelle micrométrique caractéristiques ainsi que une connexion électrique pour la détection et d&#39;actionnement. Fonctionnelles des composants biologiques donner au système la capacité pour la détection spécifique des analytes, des fonctions enzymatiques, et de cellules entières capacités. Procédés de microfabrication standard et bio-analytiques techniques ont été utilisées avec succès depuis des décennies dans les industries de l&#39;informatique et biologique, respectivement. Leur combinaison et d&#39;interface dans un environnement de laboratoire-sur-une-puce, cependant, fait naître de nouveaux défis. Il est un appel à des techniques qui peuvent construire une interface entre l&#39;électrode et Compon biologiqueent qui est doux et facile à fabriquer et le motif. Biofabrication, décrit ici, est une telle approche qui a montré de grandes promesses pour sa facilité-à-assembler l&#39;incorporation de composants biologiques avec une polyvalence dans les fonctions sur la puce qui sont activées. Biofabrication utilise des matériaux biologiques et les mécanismes biologiques (auto-assemblage, l&#39;assemblage enzymatique) pour bottom-up assemblage hiérarchique. Alors que nos laboratoires ont démontré ces concepts dans de nombreux formats 1,2,3, ici, nous démontrons le processus d&#39;assemblage basée sur électrodéposition suivie par plusieurs applications de signal basés sur des interactions. Le processus d&#39;assemblage se compose de l&#39;électrodéposition de films polymères biocompatibles stimuli-sensibles sur des électrodes et leur fonctionnalisation ultérieure avec des composants biologiques comme l&#39;ADN, les enzymes, ou des cellules vivantes 4,5. Électrodéposition tire parti du gradient de pH créée à la surface d&#39;une électrode polarisée provenant de l&#39;électrolysede l&#39;eau 6,7,. Le chitosane et l&#39;alginate sont stimuli-sensibles polymères biologiques qui peuvent être déclenchés à s&#39;auto-assembler en films d&#39;hydrogel imposées en réponse à des signaux électriques 8. L&#39;épaisseur de ces hydrogels est déterminée par la mesure dans laquelle le gradient de pH s&#39;étend de l&#39;électrode. Ceci peut être modifié en utilisant différentes densités de courant et les temps de dépôt 6,7. Ce protocole décrire comment les films sont déposés chitosane et fonctionnalisé par liaison covalente des composants biologiques à des groupes amine primaires présents abondantes sur le film à travers soit méthodes enzymatiques ou électrochimique 9,10. Films d&#39;alginate et de leur piégeage de cellules vivantes seront également abordés 11. Enfin, l&#39;utilité de biofabrication est démontrée par des exemples de l&#39;interaction fondée sur le signal, y compris les produits chimiques-électrique, la cellule à cellule, et aussi la transmission du signal enzyme-à-cellule. Tant le électrodépositionet la fonctionnalisation peut être réalisée dans des conditions proches des conditions physiologiques, sans la nécessité pour les réactifs et épargner ainsi les composantes biologiques labiles à partir des conditions très dures. En outre, à la fois le chitosane et l&#39;alginate ont été longtemps utilisées à des fins pertinentes biologiquement 12,13. Dans l&#39;ensemble, biofabrication, une technique rapide qui peut être tout simplement exécutée sur un établi, peut être utilisé pour créer des motifs de l&#39;échelle du micron fonctionnelles des composants biologiques sur des électrodes et peut être utilisé pour une variété de lab-on-a-chip applications.

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Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Cet article décrit une approche biofabrication: dépôt de stimuli-sensibles polysaccharides en présence d&#39;électrodes biaisées pour créer des films biocompatibles qui peuvent être fonctionnalisés avec des cellules ou des protéines. Nous démontrons une stratégie de paillasse pour la génération des films ainsi que leurs utilisations de base pour créer des surfaces interactives pour biofonctionnalisés lab-on-a-chip applications.

Combler l&#39;interface bio-électronique avec Biofabrication

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