Name: neural explant cultures from xenopus laevis
Uploaded: 2012-10-15T12:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare Bob Freeman per la formazione e il laboratorio Kirschner per l&#39;utilizzo della struttura rana, ed i membri del laboratorio di Víctor Van per il supporto. Ringraziamo la Nikon Imaging Center della Harvard Medical School per l&#39;assistenza con microscopio ottico per le immagini in Figura 1. Questo lavoro è stato finanziato dal seguente: NRSA NIH comunione e NIH K99 borsa di studio per LAL, Basic Science Partnership finanziamento ( <a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">https://bsp.med.harvard.edu/</a> ) a AEF, e NIH RO1 NS035909 al DVV

Nota: descrivere la procedura descritta nelle prime due sezioni solo in breve, come protocolli eccellenti con le informazioni dettagliate sono state pubblicate altrove, che si concentrano in particolare su questi passaggi (ad esempio, 8-12). Inoltre, il protocollo generale di lavorare con i neuroni spinali di Xenopus in colture cellulari in tempo reale è stato precedentemente pubblicato in un articolo dettagliato metodi 8. Consigliamo vivamente di rivedere tale articolo come un c...

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	<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li><li>Buck, K. B., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+turning+induced+by+direct+local+modification+of+microtubule+dynamics.">Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics.</a> J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).</li><li>Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. 42, 913-926 (2004).</li><li>Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+adhesion+and+signaling+dynamics+in+Xenopus+laevis+growth+cones.">Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones.</a> Dev. Neurobiol. , (2011).</li><li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation.">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).</li><li>Tanaka, E., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+growth+cone+turning+at+substrate+boundaries.">The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries.</a> J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).</li><li>Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+dynamics+in+growth+cone+motility+and+axonal+growth.">The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth.</a> J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).</li><li>Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+Xenopus+spinal+neurons+in+live+cell+culture.">Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture.</a> Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , (2010).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Eggs+from+Xenopus+laevis+Females.">Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females.</a> J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Lavery, D. L., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+and+loss-of-function+strategies+in+Xenopus.">Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Guirland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cAMP+signaling+through+G-protein-coupled+receptors+mediates+growth+cone+attraction+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide.">Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).</li><li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture.">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).</li><li>Turney, S. G., Bridgman, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+stimulates+and+guides+axonal+outgrowth+via+growth+cone+myosin+II+activity.">Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).</li><li>Weinl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+turning+of+Xenopus+retinal+axons+induced+by+ephrin-A5.">On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5.</a> Development. 130, 1635-1643 (2003).</li><li>Knoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration.">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).</li><li>Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+expression+in+transgenic+Xenopus+embryos.">Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos.</a> Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).</li></ol>

Xenopus laevis espianti neurali inviare neuriti in modo molto robusto per 24 ore dopo placcatura sul laminina / poly-lisina substrato se le condizioni sono appropriate. Con questo substrato, coni di crescita sono altamente mobili e possono raggiungere lunghezze assone fino a 1 mm, si estende in tutte le direzioni verso l&#39;esterno dal espianto, sebbene lunghezze tipiche sono 100 um o più. Se neuriti non crescono fuori, ci sono un numero limitato di ragioni per questo essere il caso. Una possibilità è che g...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Gonadotropina corionica </td><td> Argent laboratori chimici </td><td> C-HCG-ON-10 </td></tr><tr><td> Cisteina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 52-90-4 </td></tr><tr><td> mMessage mmachine kit </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td></tr><tr><td> Capillare Aghi Borosil 1,2 mm (OD) x 0,9 mm (ID) </td><td> FHC </td><td> 30-31-0 </td></tr><tr><td> Ficoll </td><td> Sigma </td><td> F2637 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Biologie Inox Pinze </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-12-1 </td></tr><tr><td> Mattek piatti </td><td> Mat Tek Corporation </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 21083-027 </td></tr><tr><td> Poly-L-lizzane </td><td> Sigma </td><td> P-1399 </td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td></tr><tr><td> NT3 </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> Sigma </td><td> B3795 </td></tr></tbody></table>

neural explant cultures from xenopus laevis

Il complesso processo di orientamento assone è dovuto in gran parte il cono di crescita, che è la struttura dinamica mobili sulla punta l&#39;assone. Durante la conseguenza dell&#39;assone, il cono di crescita deve integrare diverse fonti di informazioni di guida spunto per modulare la sua citoscheletro, al fine di spingere il cono di crescita in avanti e passare a trovare con precisione gli obiettivi specifici 1. Come tale integrazione avviene a livello citoscheletrico è ancora emergente, e l&#39;esame di proteine ​​del citoscheletro e dinamiche effettrici all&#39;interno del cono di crescita può consentire la delucidazione di questi meccanismi. Xenopus laevis coni di crescita sono abbastanza grandi (10-30 micron di diametro) per eseguire elevata -risoluzione di immagini in tempo reale della dinamica del citoscheletro (ad esempio 2-4) e sono facili da isolare e manipolare in un laboratorio rispetto ad altri vertebrati. La rana è un sistema modello classico per gli studi di sviluppo, neurobiologia e importanti intuizioni iniziali in mic cono di crescitadinamiche rotubule sono stati inizialmente trovati con questo sistema 5-7. In questo metodo 8, uova vengono raccolte e fecondati in vitro, iniettato con RNA codifica etichetta fluorescente proteine ​​di fusione o altri costrutti citoscheletro di manipolare l&#39;espressione genica, e poi lasciata sviluppare alla fase tubo neurale. Tubi neurali sono isolati da dissezione e poi sono messi in coltura, e coni di crescita di neuriti che diventano troppo grandi vengono esposte. In questo articolo, si descrive come eseguire questo metodo, il cui obiettivo è quello di cultura di Xenopus laevis coni di crescita per la successiva analisi ad alta risoluzione delle immagini. Mentre forniamo l&#39;esempio della proteina di fusione TIP + EB1-GFP, questo metodo può essere applicato a qualsiasi numero di proteine ​​di chiarire loro comportamenti nel cono di crescita.

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Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Espianti coltura neurali di sezionato<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni che esprimono proteine ​​di fusione fluorescenti permette l&#39;imaging con la dinamica del citoscheletro cono di crescita.

Culture Explant neurali di<em&gt; Xenopus laevis</em

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Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

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