Name: neural explant cultures from xenopus laevis
Uploaded: 2012-10-15T12:00:00
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Los autores desean agradecer a Bob Freeman para la formación y el laboratorio de Kirschner para la utilización de las instalaciones de rana, y los miembros del laboratorio Van Vactor para el apoyo. Damos las gracias a la Nikon Imaging Center de la Harvard Medical School de asistencia con microscopía de luz para las imágenes de la figura 1. Este trabajo fue financiado por el texto siguiente: NRSA NIH NIH K99 comunión y compañerismo con LAL, Ciencias Básicas Asociación financiación ( <a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">https://bsp.med.harvard.edu/</a> ) a AEF, y NIH RO1 NS035909 para DVV

Nota: Se describen los pasos en las dos primeras secciones sólo en pocas palabras, como los protocolos excelentes con información detallada de haber sido publicada antes que se centran más concretamente en los siguientes pasos (por ejemplo, 8-12). Además, el protocolo general de colaboración con las neuronas espinales en Xenopus cultivo de células en vivo ha sido publicado previamente en un artículo de métodos detallados 8. Le recomendamos revisar ese artículo como comple...

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	<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li><li>Buck, K. B., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+turning+induced+by+direct+local+modification+of+microtubule+dynamics.">Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics.</a> J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).</li><li>Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. 42, 913-926 (2004).</li><li>Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+adhesion+and+signaling+dynamics+in+Xenopus+laevis+growth+cones.">Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones.</a> Dev. Neurobiol. , (2011).</li><li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation.">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).</li><li>Tanaka, E., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+growth+cone+turning+at+substrate+boundaries.">The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries.</a> J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).</li><li>Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+dynamics+in+growth+cone+motility+and+axonal+growth.">The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth.</a> J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).</li><li>Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+Xenopus+spinal+neurons+in+live+cell+culture.">Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture.</a> Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , (2010).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Eggs+from+Xenopus+laevis+Females.">Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females.</a> J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Lavery, D. L., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+and+loss-of-function+strategies+in+Xenopus.">Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Guirland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cAMP+signaling+through+G-protein-coupled+receptors+mediates+growth+cone+attraction+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide.">Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).</li><li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture.">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).</li><li>Turney, S. G., Bridgman, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+stimulates+and+guides+axonal+outgrowth+via+growth+cone+myosin+II+activity.">Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).</li><li>Weinl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+turning+of+Xenopus+retinal+axons+induced+by+ephrin-A5.">On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5.</a> Development. 130, 1635-1643 (2003).</li><li>Knoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration.">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).</li><li>Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+expression+in+transgenic+Xenopus+embryos.">Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos.</a> Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).</li></ol>

Xenopus laevis explantes neuronales enviar neuritas de una manera muy robusta por 24 hr después de la siembra en la laminina / poli-lisina sustrato, si las condiciones son apropiadas. Con este sustrato, los conos de crecimiento son muy móviles y pueden alcanzar longitudes de los axones de hasta 1 mm, que se extiende en todas las direcciones hacia el exterior a partir del explante, aunque longitudes típicas son 100 micras o más. Si neuritas no crecen hacia fuera, hay un número limitado de razones para que e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Gonadotropina Coriónica </td><td> Argent Chemical Laboratories </td><td> C-HCG-ON-10 </td></tr><tr><td> Cisteína </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 52-90-4 </td></tr><tr><td> mMessage mMachine kit </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td></tr><tr><td> Capilar Agujas Borosil 1,2 mm (diámetro exterior) x 0,9 mm (ID) </td><td> FHC </td><td> 30-31-0 </td></tr><tr><td> Ficoll </td><td> Sigma </td><td> F2637 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Biologie Inox Pinzas </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> La colagenasa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-12-1 </td></tr><tr><td> Mattek platos </td><td> Mat Tek Corporation </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 21083-027 </td></tr><tr><td> Poli-L-Lysinordeste </td><td> Sigma </td><td> P-1399 </td></tr><tr><td> La laminina </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td></tr><tr><td> NT3 </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> Sigma </td><td> B3795 </td></tr></tbody></table>

neural explant cultures from xenopus laevis

El complejo proceso de orientación axón está impulsado principalmente por el cono de crecimiento, que es la estructura dinámica móviles en la punta del axón en crecimiento. Durante axón resultado, el cono de crecimiento debe integrar múltiples fuentes de información de guía señal para modular su citoesqueleto con el fin de propulsar el cono de crecimiento hacia adelante y precisa navegar a encontrar sus objetivos específicos 1. Cómo esta integración se produce a nivel del citoesqueleto todavía está emergiendo, y el examen de proteína del citoesqueleto y la dinámica efectoras dentro del cono de crecimiento puede permitir la elucidación de estos mecanismos. Xenopus laevis conos de crecimiento son lo suficientemente grandes (10-30 micras de diámetro) para realizar alta resolución de imagen en directo de la dinámica del citoesqueleto (por ejemplo, 2-4) y son fáciles de aislar y manipular en un ambiente de laboratorio en comparación con otros vertebrados. La rana es un sistema modelo clásico de desarrollo de los estudios de neurobiología e importantes reflexiones tempranas en mic cono de crecimientodinámica rotubule se encontraron inicialmente utilizando este sistema de 5-7. En este método 8, se recogen los huevos y fertilizados in vitro, inyectados con ARN que codifica las proteínas de fusión etiquetadas fluorescentemente citoesqueleto o de otras construcciones para manipular la expresión génica, y luego se dejó desarrollar a la etapa del tubo neural. Tubos neurales están aislados por la disección y luego cultivadas son, y los conos de crecimiento de neuritas outgrowing fotografiado está. En este artículo, se describe cómo llevar a cabo este método, el objetivo de las cuales es para los conos de crecimiento de cultivo de Xenopus laevis para su posterior análisis de imágenes de alta resolución. Si bien damos el ejemplo de proteína de fusión + TIP EB1-GFP, este método se puede aplicar a cualquier número de proteínas para dilucidar sus comportamientos en el cono de crecimiento.

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Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Cultivo de explantes neuronales de disección<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriones que expresan proteínas fluorescentes de fusión permite la obtención de imágenes de cono de crecimiento dinámica del citoesqueleto.

Los cultivos neuronales de explantes de<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

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Neural formadoras de colonias ensayo de células: un ensayo para discriminar Bona Fide células troncales nerviosas de células progenitoras neurales

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