Name: neural explant cultures from xenopus laevis
Uploaded: 2012-10-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neural Explant Cultures from Xenopus laevis at JoVE.com

Författarna vill tacka Bob Freeman för utbildning och Kirschner labbet för användning av grodan anläggningen och medlemmar av Van Vactor labbet för support. Vi tackar Nikon Imaging Center vid Harvard Medical School för att få hjälp med ljusmikroskop för bilderna i figur 1. Detta arbete har finansierats av följande: NRSA NIH gemenskap och NIH K99 gemenskap till LAL, Basic Science Partnership finansiering ( <a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">https://bsp.med.harvard.edu/</a> ) till AEF, och NIH RO1 NS035909 till DVV

Obs: Vi beskriver stegen i de två första avsnitten bara i korthet, som utmärkta protokoll med detaljerad information har publicerats på annat håll som fokuserar mer specifikt på dessa steg (t.ex. 8-12). Dessutom har det allmänna protokollet av att arbeta med Xenopus spinala neuron i levande cellkultur tidigare publicerats i en detaljerad metoder artikel 8. Vi rekommenderar starkt över denna artikel som ett komplement till den här videon, men här vi ge tillräckligt med i...

<ol>
	<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li><li>Buck, K. B., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+turning+induced+by+direct+local+modification+of+microtubule+dynamics.">Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics.</a> J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).</li><li>Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. 42, 913-926 (2004).</li><li>Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+adhesion+and+signaling+dynamics+in+Xenopus+laevis+growth+cones.">Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones.</a> Dev. Neurobiol. , (2011).</li><li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation.">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).</li><li>Tanaka, E., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+growth+cone+turning+at+substrate+boundaries.">The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries.</a> J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).</li><li>Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+dynamics+in+growth+cone+motility+and+axonal+growth.">The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth.</a> J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).</li><li>Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+Xenopus+spinal+neurons+in+live+cell+culture.">Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture.</a> Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , (2010).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Eggs+from+Xenopus+laevis+Females.">Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females.</a> J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Lavery, D. L., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+and+loss-of-function+strategies+in+Xenopus.">Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Guirland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cAMP+signaling+through+G-protein-coupled+receptors+mediates+growth+cone+attraction+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide.">Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).</li><li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture.">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).</li><li>Turney, S. G., Bridgman, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+stimulates+and+guides+axonal+outgrowth+via+growth+cone+myosin+II+activity.">Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).</li><li>Weinl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+turning+of+Xenopus+retinal+axons+induced+by+ephrin-A5.">On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5.</a> Development. 130, 1635-1643 (2003).</li><li>Knoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration.">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).</li><li>Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+expression+in+transgenic+Xenopus+embryos.">Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos.</a> Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).</li></ol>

Xenopus laevis neurala explantat skicka ut neuriter i ett mycket robust sätt genom 24 timmar efter plätering på laminin / poly-lysin substrat om förhållandena är lämpliga. Med detta substrat, tillväxt koner är mycket rörliga och kan uppnå axon längder upp till 1 mm, som sträcker sig i alla riktningar utåt från explantatet, fastän typiska längder är 100 um eller mer. Om neuriter inte växer ut, det finns ett begränsat antal skäl till detta vara fallet. En möjlighet är att de neurala explant...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Koriongonadotropin </td><td> Argent Kemiska Laboratories </td><td> C-HCG-ON-10 </td></tr><tr><td> Cystein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 52-90-4 </td></tr><tr><td> mMessage mMachine kit </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td></tr><tr><td> Kapillär Borosil Needles 1,2 mm (OD) x 0,9 mm (ID) </td><td> FHC </td><td> 30-31-0 </td></tr><tr><td> Ficoll </td><td> Sigma </td><td> F2637 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Biologie Inox Tång </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.252-20 </td></tr><tr><td> Kollagenas </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-12-1 </td></tr><tr><td> Mattek rätter </td><td> Mat Tek Corporation </td><td> P35G-1.5-14-C- </td></tr><tr><td> L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 21083-027 </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysine </td><td> Sigma </td><td> P-1399 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td></tr><tr><td> NT3 </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> Sigma </td><td> B3795 </td></tr></tbody></table>

neural explant cultures from xenopus laevis

Den komplexa processen att axonet vägledning till stor del driven av tillväxt konen, vilket är den dynamiska rörliga strukturen på spetsen av den växande axonet. Under axonet utväxt, måste tillväxten konen integrera flera källor för vägledning kö information modulera sin cytoskelettet för att driva tillväxten konen framåt och exakt navigera för att hitta de särskilda målen 1. Hur denna integration sker på cytoskelett nivån fortfarande fram, och granskning av cytoskelett protein och effektor dynamiken inom tillväxt konen kan tillåta att klarlägga dessa mekanismer. Xenopus laevis tillväxt koner är tillräckligt stora (10-30 mikrometer i diameter) för att utföra hög upplösning levande avbildning av cytoskelettala dynamik (t.ex. 2-4) och är lätta att isolera och manipulera i ett labb miljö jämfört med andra ryggradsdjur. Grodan är en klassisk modell för utvecklings neurobiologi studier och viktiga tidiga insikter tillväxt konen mikrofonrotubule dynamik ursprungligen hittas med hjälp av detta system 5-7. I denna metod 8, ägg uppsamlas och befruktas in vitro, injicerades med RNA som kodar fluorescerande märkta cytoskelettala fusionsproteiner eller andra konstruktioner för att manipulera genuttryck, och fick sedan utvecklas till neuralröret stadiet. Neurala rör isoleras genom dissektion och sedan odlas och tillväxt kottar på var större än neuriter avbildas. I den här artikeln beskriver vi hur du utför denna metod vars mål är att kultur Xenopus laevis tillväxt koner för efterföljande högupplöst bildanalys. Medan vi ger exempel + TIPS fusionsprotein EB1-GFP, kan denna metod tillämpas på ett antal proteiner för att belysa deras beteenden inom tillväxt konen.

Watch this Scientific Journal Video about Neural Explant Cultures from Xenopus laevis at JoVE.com

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Odling neurala explantat från dissekeras<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryon som uttrycker fluorescerande fusionsproteiner medger avbildning av cytoskelettala tillväxt kon dynamik.

Neurala Explantation kulturer från<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-kolonibildande Cell-analys: en analys att diskriminera Bona Fide neuronala stamceller från neurala stamceller

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Härledning av anrikat Oligodendrocyte kulturer och Oligodendrocyte / Neuron Myelinating Co-kulturer från Postnatal Murine vävnader

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissektion, kultur, och analys av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonala näthinnevävnad

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Samtidig före och postsynaptiska Elektrofysiologisk inspelning från<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerve-muskel samkulturer

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Neural Circuit Spela in från en Intakt kackerlacka Nervsystemet

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, två kulturer: isolering och odling av vuxna neurala stamceller från de två neurogen zoner Individuell möss

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

En enkel Behavioral analys för Testa Visual Function i<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Inspelning Temperatur-inducerad neuronal aktivitet genom att övervaka Kalcium Förändringar i luktbulben av<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Härledning av Leptomeninges Explantation kulturer från obduktions Human Brain Donatorer

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...