Name: an analytical tool that quantifies cellular morphology changes from three-dimensional fluorescence images
Uploaded: 2012-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images at JoVE.com

Vi tackar biologisk avbildning Development Center (BIDC) University of California, San Francisco för användning av Imaris, Imaris XT och Matlab. Vi tackar V. Kharazia för tekniskt bistånd och på Henry, LK Floren, L. Daitch för deras bidrag till redigering av manuskriptet. Detta arbete stöddes av medel från staten Kalifornien medicinsk forskning på alkohol och missbruk genom UCSF till SEB, National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 och NIH Fast Track utmärkelse att screena MLSMR samlingen till SEB, UCSF School of Pharmacy ( Dean kansli och klinisk farmaci) och School of Medicine (Clinical Pharmacology &amp; Experimental Therapeutics) i CLHK.

1. Tredimensionell Morfometrisk analys av Encelliga fenotypiska förändringar <ol><li> Humana embryonala njur-(HEK293)-celler transfekterades med hemagglutinin (HA)-märkta kortikotropinfrisättande faktor-receptor-2 (CRF-R2), beskrev en G-proteinkopplad receptor (GPCR) såsom tidigare 4, 5. </li><li> Cellerna lämnades obehandlade (ingen behandling, NT), stimulerades med CRF-R2 endogen ligand, kortikotropinfrisättande faktor, CRF (1 pM, 30 min), eller förbehandlade med en selektiv CRF-R2-antagonist, ant...

<ol>
	<li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereological+methods+for+counting+neurons.">Design-based stereological methods for counting neurons.</a> Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).</li><li>Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowing+what+counts:+unbiased+stereology+in+the+non-human+primate+brain.">Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain.</a> J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).</li><li>Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+morphometry+and+cell-cell+communication+of+the+osteocyte+network+in+chick+and+mouse+embryonic+calvaria.">The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria.</a> Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).</li><li>Vickery, R. G., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+dynamin-dependent+and+-independent+mechanisms+target+structurally+homologous+dopamine+receptors+to+different+endocytic+membranes.">Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes.</a> J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).</li><li>Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+responsiveness+is+regulated+by+targeted+sorting+of+D2+receptors.">Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors.</a> Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).</li><li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry.">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).</li><li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial+morphogenesis.">Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).</li><li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis.">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> J. Microsc. 227, 140-156 (2007).</li><li>Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+single-cell+dynamics.">Measurement of single-cell dynamics.</a> Nature. 465, 736-745 (2010).</li><li>Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+multivariate+profiling+of+drug+responses+from+single+cells.">Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells.</a> Nat Methods. 4, 445-453 (2007).</li><li>Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+cell+migration+inhibitors+via+automated+microscopy+reveals+a+Rho-kinase+inhibitor.">Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor.</a> Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).</li></ol>

Vi visade att CRF behandling inducerade en signifikant förändring i morfologi och lokalisering av CRF-R2. Förändringen i CRF-R2 inhiberades genom selektiv antagonist behandling. Vi visade att receptor ändringar inte upptäcktes och kan inte mätas med de vanliga 2D multispektrala tekniker. Förmågan att studera komplexa 3D-bilder är avgörande att införliva komplicerade biologiska parametrar för morfometrisk analys. Vi skulle kunna göra 3D mätningar av celler utan en fördefinierad form med inkonsekventa fluo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> Humana embryonala Njure (HEK293) </td><td> American Type Culture Collection </td><td> CRL-1573 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965118 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor-488 (IgG2b) </td><td> Invitrogen </td><td> A-11001 </td><td></td></tr><tr><td> monoklonal anti-HA.11 (IgG 1) </td><td> Covance </td><td> 16B12 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Vector Laboratories </td><td> ^ H-1200 </td><td>; </td></tr><tr><td> CRF </td><td> Sigma </td><td> C2917 </td><td></td></tr><tr><td> Antisauvagine-30 (AS-30) </td><td> Sigma </td><td> A4727 </td><td></td></tr></tbody></table>

an analytical tool that quantifies cellular morphology changes from three-dimensional fluorescence images

De vanligaste programvara analysverktyg tillgängliga för mätning av fluorescens bilder är för tvådimensionella (2D) data som är beroende av manuella inställningar för inkludering och exkludering av datapunkter och datorstödd mönsterigenkänning för att stödja tolkningen och slutsatserna av analysen. Det har blivit allt viktigare att kunna mäta fluorescensbilder konstruerade från tredimensionella (3D) datamängder för att kunna fånga komplexiteten i cellulära dynamik och förstå grunden för cellulära plasticitet i biologiska system. Sofistikerade mikroskopi instrument har gjort det möjligt att visualisering av 3D fluorescens bilder genom förvärv av multispektrala fluorescens bilder och kraftfulla analytiska programvara som rekonstruerar bilderna från konfokala stackar som sedan ger en 3D-representation av de insamlade 2D-bilder. Advanced Design-baserade Stereology metoder har utvecklats av tillnärmningen och antaganden av OriginaL modellbaserad Stereology 1 även i komplexa vävnadssnitt 2. Trots dessa vetenskapliga framsteg inom mikroskopi, kvarstår ett behov av en automatiserad analytisk metod som till fullo utnyttjar de inneboende 3D-data för att möjliggöra analys och kvantifiering av komplexa förändringar i cellmorfologi, protein lokalisering och receptor människohandel. Aktuella tekniker som är tillgängliga för att kvantifiera fluorescensbilder inkluderar Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) och Image J (NIH) som ger manuell analys. Imaris (Andor Technology, Belfast, Nordirland) programvara ger funktionen MeasurementPro som gör den manuella skapandet av mätpunkter som kan placeras i en volym bild eller dras på en serie av 2D skivor för att skapa en 3D-objekt. Denna metod är användbar för enda klick punkt mätningar för att mäta en linje avståndet mellan två objekt eller för att skapa en polygon som omsluter ett område av intresse, men det är svårt att tillämpa komplex mobiltelenätet strukturer. Filament Tracer (Andor) medger automatisk detektering av 3D neuronala trådliknande har dock denna modul har utvecklats för att mäta definierade strukturer som nervceller, som består av dendriter, axoner och ryggar (trädliknande struktur). Denna modul genialt har använts för att göra morfologiska mätningar till icke-neuronala celler 3, men utdata ger information av en förlängd mobiltelefonnät genom att använda en programvara som är beroende av en definierad cellform snarare än en amorf formad cellulär modell. För att övervinna problemet att analysera amorf-formade celler och göra programvaran mer lämplig för en biologisk applikation, utvecklade Imaris Imaris Cell. Detta var ett vetenskapligt projekt med Eidgenössische Technische Hochschule, som har utvecklats för att beräkna förhållandet mellan celler och organeller. Medan mjukvaran möjliggör detektering av biologiska begränsningar, genom att tvinga en kärna per celloch använder cellmembran till segmentet celler, kan det inte användas för att analysera fluorescensdata som inte fortlöpande eftersom idealt det bygger cellytan utan tomrum. Såvitt vi vet, för närvarande inget användaren modifierbar automatiserad metod som ger morfometrisk information från 3D fluorescensbilder har utvecklats som uppnår cellulär geografisk information i en odefinierad form (figur 1). Vi har utvecklat en analytisk plattform med Imaris modulen kärnan programvara och Imaris XT gränssnitt till MATLAB (Mat Works, Inc.). Dessa verktyg tillåter 3D-mätning av celler utan en fördefinierad form och med inkonsekventa fluorescens nätverkskomponenter. Dessutom kommer denna metod att forskare som har utökat kompetens inom biologiska system, men inte förtrogenhet med datortillämpningar, att utföra kvantifiering av morfologiska förändringar i celler dynamik.

Watch this Scientific Journal Video about An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images at JoVE.com

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Vi utvecklade en mjukvaruplattform som använder Imaris neurovetenskap, ImarisXT och MATLAB för att mäta förändringar i morfologi ett odefinierat form tas från tredimensionell konfokal fluorescens av enstaka celler. Denna nya metod kan användas för att kvantifiera förändringar i cellernas form efter receptoraktivering och därför representerar en möjlig ytterligare verktyg för läkemedelsutveckling.

Ett analysverktyg som kvantifierar cellulär morfologi Ändringar från Tredimensionella fluorescensbilder

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

Chip-baserade tredimensionella Cell Kultur i perfusion Micro-bioreaktorer

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Mikrofabrikation av Chip-storlek Byggnadsställningar för tredimensionell cellodling

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

En hög genomströmning metod för att globalt studera organell morfologi i S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Montering, lastning och Uppriktning av en analytisk ultracentrifugen Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Förändringar i bröstkörtlarna Morfologi och bröstcancerrisk hos råttor

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Isolering av bröstepitelialceller celler från tre-dimensionell Mixed-cell sfäroid Co-kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snabb analys och utforskningen av fluorescensmikroskopi bilder

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tredimensionella Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Kvantitativa metoder för att studera cellulära strukturer och organell morfologi i Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Single-Cell Resolution Tredimensionell avbildning av intakta organoider

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...