Name: monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters
Uploaded: 2012-09-27T13:00:00
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这项工作是支持的，部分由美国国家科学基金会（IOS-0920417）（ACL）。

1。构建慢病毒荧光素酶记者哺乳动物的昼夜记者的结构通常包含一个表达盒，其中一昼夜的荧光素酶基因启动子的融合。双方结扎和重组基于策略通常用于DNA克隆。作为一个例子，在这里，我们描述了一个重组的Gateway克隆方法产生一个P（Per2基因 ）-D 吕克慢记者，在不稳定的荧光素酶 （D 吕克 ）的小鼠Per2基因启动子的控制下。 <ol>...

1。目前的协议的修改 1.1记录装置和吞吐量的考虑由于其商用中，LumiCycle（Actimetrics）已成为最常用的自动光度计设备实时记录4,5,9,19,29-31的 。 LumiCycle采用光电倍增管（PMT）作为光探测器，它提供了极高的灵敏度和低噪声14，因此特别适合于数据采集极其暗淡的基于荧光素酶发光。其他相似的PMT的设备（ 例如 ，克罗诺斯，阿托公司; POL...

<table border="1"><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>胎牛血清</td><td> SH30243FS </td><td>对于正常细胞生长</td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen公司</td><td> 12100-046 </td><td>对于luminometry </td></tr><tr><td> FBS </td><td>胎牛血清</td><td> SH3091003 </td><td></td></tr><tr><td>青/链霉素/谷氨酰胺（100X） </td><td>胎牛血清</td><td> SV3008201 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 </td><td> Invitrogen公司</td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> D-荧光素</td><td> Biosynth </td><td> L-8220 </td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>西格玛</td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>密理博</td><td&gt; TR-1003-G </td><td></td></tr><tr><td>佛司可林</td><td>西格玛</td><td> F6886 </td><td></td></tr><tr><td>所有其他化学品</td><td>西格玛</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 设备 </td></tr><tr><td>组织培养箱</td><td></td><td></td><td>在37°C，5％CO2 </td></tr><tr><td>组织培养罩</td><td></td><td></td><td> BSL-2认证</td></tr><tr><td>光与荧光显微镜</td><td></td><td></td><td>相衬可选</td></tr><tr><td> LumiCycle </td><td> Actimetrics </td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters

在哺乳动物中，许多方面的行为和生理的，如睡眠-觉醒周期和肝脏代谢的调节内源性生物钟（审阅1,2）。时间的昼夜节律系统是一个分层的多振荡器网络，与中央的时钟位于视交叉上核（SCN）同步和协调其他额外的SCN和外设时钟1,2。单个细胞的生成和维护的昼夜节律3,4，这些振荡器在有机体份额显着相似的生化负反馈机制的不同组织类型的功能单元。然而，由于在神经元网络级在SCN和有机体一级通过节奏，系统性的线索的相互作用，在有机体一级的昼夜节律不一定细胞自主5-7。相对于传统的研究在体内的自发活动和SCN外植体离体 ，CELL-总部设在体外实验中可以发现的细胞自主的昼夜缺陷5,8。在战略上，基于细胞的实验模型更易于处理的表型特征和基本时钟机制的快速发现5,8-13。 因为昼夜节律是动态的，纵向的高时间分辨率的测量来评估时钟功能。近年来，实时使用萤火虫荧光素酶的生物发光记录，记者已成为一种常见的技术研究在哺乳动物中的昼夜节律14,15，因为它允许分子节奏的持久性和动态检查。细胞的自我监控的昼夜节律基因表达，荧光素酶记者可以被引入到细胞通过瞬时转染13,16,17或稳定转导5,10,18,19。在这里，我们描述了一个稳定传导协议的慢病毒介导的基因传递。 Ţ他慢病毒载体系统是优于传统的方法，如瞬时转染和生殖传输，因为它的效率和多功能性：它可以有效地提供稳定整合到宿主基因组的分裂和非分裂细胞20。记者细胞系建立之后，时钟功能的动态可以检查通过生物发光记录。我们首先介绍了新一代的P（Per2基因 ）-D 吕克记者的线条，然后和其他昼夜记者从目前的数据。在这些实验中，3T3小鼠成纤维细胞和U2OS人骨肉瘤细胞被用作细胞模型。我们还讨论了不同的方式使用这些时钟模型在昼夜节律的研究。这里描述的方法可以应用到多种类型的细胞，研究细胞和分子基础的生物钟，并在处理其他生物系统的问题可能会被证明是有用的。

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Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

生物钟单个细胞内发挥作用，也就是说，它们是细胞的自我。在这里，我们描述了使用非侵入性，实时荧光素酶为基础的生物发光技术产生的细胞自主的时钟模型的方法。记者细胞提供听话的，功能性的昼夜节律生物学研究的模型系统。

监测细胞自主的生物钟节律基因表达，利用荧光素酶生物发光记者

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

使用微阵列的细菌基因表达分析

科研

生物学

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

主电穿孔的小鼠骨髓造血细胞培养制备

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

全球基因表达分析，使用斑马鱼的寡核苷酸芯片平台

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

使用基因脉冲MXcell电穿孔系统主细胞的转染效率高

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

使用自动细胞计数器简化基因表达研究：在Namalwa细胞的IL - 4依赖的基因表达的siRNA击倒

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

石蜡包埋及冷冻的部分果蝇成人肌肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

在体外重组活跃T。谷盗端粒酶

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

全球合成的RNA在单细胞水平以下的低氧分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

代谢率的测量<em&gt;果蝇</em&gt;使用呼吸运动

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

转染RAW264.7细胞用荧光素酶报告基因

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...