Name: monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters
Uploaded: 2012-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters at JoVE.com

Dit werk werd mede ondersteund door de National Science Foundation (IOS-0920417) (ACL).

1. Bouw van Lentivirale Luciferase Reporters Een zoogdier circadiane reporter construct bevat gewoonlijk een expressie-cassette waarin een circadiane promoter gefuseerd met het luciferase gen. Zowel ligatie en recombinatie gebaseerde strategieën worden gebruikt voor DNA klonering. Als voorbeeld beschrijven we een recombinatie gebaseerde Gateway kloneringswerkwijze voor het genereren van P (Per2)-d Luc reporter lentivirale, waarin het gedestabiliseerd luciferase (Luc...

1. Wijzigingen aan huidige protocol 1.1 Opname apparaten en doorvoer overwegingen Vanwege de commerciële beschikbaarheid, heeft de LumiCycle (Actimetrics) uitgegroeid tot de meest gebruikte automatische luminometer apparaat voor real-time opname 4,5,9,19,29-31. De LumiCycle werken fotomultiplicatorbuizen (PMTs) als lichtdetectoren, die zeer hoge gevoeligheid en weinig ruis 14 te verschaffen, en is daarom bijzonder geschikt voor data-acquisitie v...

<table border="1"><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> HyClone </td><td> SH30243FS </td><td> Voor reguliere celgroei </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td> Voor luminometry </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3091003 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep / Gin (100x) </td><td> HyClone </td><td> SV3008201 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td> Biosynth </td><td> L-8220 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Polybreen </td><td> Millipore </td><td&gt; TR-1003-G </td><td></td></tr><tr><td> Forskoline </td><td> Sigma </td><td> F6886 </td><td></td></tr><tr><td> Alle andere chemicaliën </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Weefselkweek incubator </td><td></td><td></td><td> 5% CO2 bij 37 ° C </td></tr><tr><td> Weefselkweek kap </td><td></td><td></td><td> BSL-2 gecertificeerd </td></tr><tr><td> Light &amp; fluorescentiemicroscoop </td><td></td><td></td><td> Fasecontrast optionele </td></tr><tr><td> LumiCycle </td><td> Actimetrics </td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters

In zoogdieren, zijn veel aspecten van het gedrag en de fysiologie, zoals slaap-waak cyclus en de lever metabolisme gereguleerd door endogene circadiane klokken (beoordeeld 1,2). De circadiane tijdwaarneming systeem is een hiërarchisch multi-oscillator-netwerk, met de centrale klok in de suprachiasmatische kern (SCN) synchroniseren en coördineren van extra-SCN en perifere klokken elders 1,2. Individuele cellen de functionele eenheden voor het genereren en onderhouden van circadiane ritmes 3,4, en deze oscillatoren van verschillende weefseltypen in het organisme hebben een opmerkelijk vergelijkbare biochemische mechanisme van negatieve feedback. Vanwege interacties op het neurale netwerk niveau in de SCN en door ritmische, systemische signalen op de organismaal niveau worden circadiane ritmes op organismaal niveau niet noodzakelijk cel-autonome 5-7. Vergeleken met traditionele studies van bewegingsactiviteit in vivo en ex vivo SCN explantaten, cell-gebaseerd in vitro assays zorgen voor ontdekking van cel-autonome circadiane gebreken 5,8. Strategisch, cel-gebaseerde modellen zijn meer experimenteel handelbaarder voor fenotypische karakterisering en snelle ontdekking van de fundamentele klokmechanismen 5,8-13. Omdat circadiaanse ritmes zijn dynamische, zijn longitudinale metingen met een hoge temporele resolutie die nodig is om klokfunctie te beoordelen. In de afgelopen jaren is real-time opname met bioluminescentie vuurvlieg luciferase reporter als een gebruikelijke techniek voor het bestuderen circadiane ritmes in zoogdieren 14,15, omdat het zorgt voor het onderzoek van de persistentie en dynamica van moleculaire ritmes. Om cel-autonome circadiane ritmes van genexpressie controleren, kan luciferase reporters in cellen worden geïntroduceerd via transiënte transfectie 13,16,17 of stabiele transductie 5,10,18,19. Hier beschrijven we een stabiele transductie protocol met lentivirus gemedieerde genafgifte. Thij lentivirale vector systeem superieur aan traditionele methoden zoals voorbijgaande transfectie en kiemlijntransmissie vanwege de efficiëntie en de veelzijdigheid en maakt het mogelijk efficiënte levering en stabiele integratie in het gastheergenoom van zowel delende als niet-delende cellen 20. Zodra een reporter cellijn wordt vastgesteld, kan de dynamiek van klokfunctie worden onderzocht door middel van bioluminescentie opname. We beschrijven eerst de generatie van P (Per2)-d Luc reporter lijnen, en vervolgens presenteren van gegevens uit deze en andere circadiane verslaggevers. In deze testen worden 3T3 muisfibroblasten en U2OS menselijke osteosarcoomcellen als cellulaire modellen. We bespreken ook de verschillende manieren van het gebruik van deze klok modellen in circadiane studies. Hier beschreven methoden kunnen worden toegepast op een grote verscheidenheid aan celtypen om de cellulaire en moleculaire basis van biologische klok bestuderen en kan nuttig zijn in de aanpak van problemen in andere biologische systemen.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters at JoVE.com

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Global analyse van genexpressie met behulp van een zebravis oligonucleotide microarray platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffine ingebedde en vriescoupes van Drosophila Adult Spieren

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Meting van Metabolic Rate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gebruik respirometrietest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfecteren RAW264.7 cellen met een luciferasereportergen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...