Name: piggybac transposon system modification of primary human t cells
Uploaded: 2012-11-05T12:00:00
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SS wird teilweise durch die HHMI Med in Grad Training Grant durch die TBMM Programm unterstützt. MHW wird teilweise durch einen Career Development Award vom Department of Veterans Affairs und der großzügigen Unterstützung der Dr. and Mrs. Harold M. Selzman unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil auch von NIH Lymphom SPORE Gewährung P50CA126752 und NIH R01 DK093660 unterstützt.

Tag 0 Ein. Isolierung von PBMCs aus menschlichem Blut <ol><li> Collect 20 ml frischem menschlichem Blut mit Venenpunktion in Na-Heparin Vacutainer-Röhrchen. </li><li> Mischung Blut und erweiterte RPMI 1640 in 1:1 (v / v)-Verhältnis. </li><li> 20 ml Lymphoprep Mediums auf eine 50 ml-Zentrifugenröhrchen (25 ° C). Langsam Schicht 25-30 ml Blut-RPMI 1640 Mix auf der Oberseite des Lymphoprep. </li><li> Zentrifugation bei 400 xg für 40 min ohne Bremsen. </li><li> Sammeln Sie beide unterschiedl...

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	<li>Cary, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mutagenesis+of+baculoviruses:+analysis+of+Trichoplusia+ni+transposon+IFP2+insertions+within+the+FP-locus+of+nuclear+polyhedrosis+viruses.">Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.</a> Virology. 172 (1), 156 (1989).</li><li>Fraser, M. 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Das hierin beschriebene Verfahren erlaubt eine stabile Modifikation Transgen von primären humanen T-Lymphozyten. Wir haben zuvor die Verwendung des piggyBac Transposonsystem getestet, um T-Zellen zu modifizieren, um ein Reporter-Gen (für mehr als 4 Wochen), eine nicht-immunogene Suizidgen, einem chimären Antigenrezeptors für adoptive Immuntherapie (länger als 100 Tage) ausdrücken, und um den Widerstand gegen immunsuppressive Medikamente 7,13-15 konstruieren. Nicht-virale Modifikation von T-Zell...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Lympholyte </td><td> Cedarlane </td><td> CL5015 </td><td></td></tr><tr><td> Erweiterte RPMI 1640 </td><td> LifeTechnologies </td><td> 12633020 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone Fetal Bovine Serum </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3008803 </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX-I Supplement </td><td> LifeTechnologies </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> Human IL-15 Recombinant Protein </td><td> eBioscience </td><td> 14-8159 </td><td></td></tr><tr><td> EndoFree Plasmid Maxi Kit </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001S </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Humane T-Zell Nucleofector Kit </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CD8-APC </td><td> Southern Biotech </td><td> 9536-11 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human CD3 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0037-81 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human CD28 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555725 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Well Tissue Culture behandelte Platte </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Well Non Tissue Culture behandelte Platte </td><td> BD Falcon </td><td> 351147 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Komplette T-Zell-Media-Komposition 1x Erweiterte RPMI 1640 5% Hitze inaktiviertem fötalem Rinderserum 2 mM GlutamaxIM-I </td></tr></tbody></table>

piggybac transposon system modification of primary human t cells

Die piggyBac Transposonsystem ist natürlich aktiv, ursprünglich aus dem Kohlspannerraupe Motte 1,2 abgeleitet. Diese nicht-viralen Plasmid basierten System ist, am häufigsten unter Verwendung von zwei Plasmide mit einer Expression der Transposase piggyBac Enzym und ein Transposon-Plasmid beherbergt, der das Gen (e) von Interesse zwischen invertierten Wiederholung Elemente, die für den Gentransfer-Aktivität erforderlich sind. PiggyBac vermittelt Gentransfer durch &quot;cut and paste&quot;-Mechanismus, wobei die Transposase integriert das Transposon-Segment in das Genom der Zielzelle (n) von Interesse. piggyBac hat effizienten Gentransfer-Aktivität in einer breiten Vielzahl von Insekten 1,2, Säuger 3-5 gezeigt, und Menschen cells6 einschließlich der primären menschlichen T-Zellen 7,8. Kürzlich wurde ein hyperaktives piggyBac Transposase erzeugt Verbesserung Gentransfereffizienz 9,10. Menschliche T-Lymphozyten sind von klinischen interest für Immuntherapie von Krebs 11. Zu beachten ist, hat die erste klinische Studie mit Transposon Veränderung der menschlichen T-Zellen mit dem Dornröschen Transposon System 12 zugelassen. Wir haben zuvor die Nützlichkeit piggyBac als nicht-viralen Methoden zur genetischen Modifikation von menschlichen T-Zellen ausgewertet. Wir fanden piggyBac zu einer genetischen Veränderung von menschlichen T-Zellen mit einem Reportergen und eine nicht-immunogene Suizidgen induzierbar 7 effizient. Analyse von genomischen Integration Seiten offenbart einen Mangel an Präferenz für die Integration in oder in der Nähe bekannter Proto-Onkogene 13. Wir verwendeten piggyBac Gen-modify zytotoxische T-Lymphozyten, um einen chimären Antigen-Rezeptor gegen den Tumor-Antigen HER2 gerichteten tragen, und festgestellt, dass Gen-modifizierten T-Zellen gezielt vermittelte Abtötung von HER2-positiver Tumorzellen in vitro und in vivo in einem orthotopen Mausmodell 14. Wir haben auch verwendet piggyBacdie menschliche T-Zellen resistent gegen Rapamycin, die nützlich sein sollen von Krebstherapien, wo Rapamycin 15 ausgenutzt wird zu erzeugen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Verwendung piggyBac genetisch zu verändern primären humanen T-Zellen. Dies beinhaltet Isolation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus menschlichem Blut durch Kultur, genetischen Veränderung, und Aktivierung von T-Zellen folgt. Für die Zwecke dieser Bericht wurden T-Zellen mit einem Reportergen (eGFP) zur Analyse und Quantifizierung der Genexpression durch Durchflusszytometrie modifiziert. PiggyBac kann zum menschlichen T-Zellen mit einer Vielzahl von Genen von Interesse zu modifizieren. Obwohl wir verwendet piggyBac an T-Zellen gegen Tumorantigene 14 lenken sind, haben wir auch verwendet, um einen induzierbaren piggyBac Sicherheitsschalter zuzusetzen, um Gen-modifizierten Zellen zu eliminieren, wenn nötig 7. Die große Ladekapazität von piggyBac auch Gentransfer aktivierteine große Rapamycin resistenten mTOR-Molekül (15 kb) 15. Daher stellen wir eine nicht-viralen Methodik für stabile Gen-Modifikation von primären humanen T-Zellen für eine Vielzahl von Zwecken.

Eine schematische demonstrieren die Schritte in genetisch modifizierenden menschlichen T-Lymphozyten mit einem Reportergen (eGFP) ist in Abbildung 1 gezeigt. Diese Plasmide sind auf Anfrage bei den Autoren. Ein schemtic demonstrieren die Schritte in gentechnisch veränderten humanen T-Lymphozyten mit einem Reportergen (eGFP) ist showin in 2. Es ist notwendig, T-Zellen zu aktivieren, um sie zu teilen, zu erweitern, und Propagation in Kultur. Modifiziertes humanes T-Zellen wurden dann gez...

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piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Wir beschreiben ein Verfahren zur genetischen Veränderung primären humanen T-Zellen mit einem Transgen unter Verwendung des nicht-viralen<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposon-System. T-Zellen zur Verwendung der modifizierte<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposonsystem Ausstellung stabile Transgenexpression.

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Mit Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon-vermittelte Mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

Beurteilung der immunmodulatorischen Eigenschaften von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Bewertung der synaptischen Schnittstelle der primären menschlichen T-Zellen aus peripherem Blut und Lymphgewebe

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...