Name: piggybac transposon system modification of primary human t cells
Uploaded: 2012-11-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells at JoVE.com

האס נתמך בחלקו על ידי HHMI המד לגראד ההדרכה גרנט באמצעות תכנית TBMM. MHW נתמך בחלקו על ידי פרס קריירת פיתוח מהמחלקה לענייני יוצאי הצבא ותמיכתה הנדיבה של ד&quot;ר והגב &#39;הרולד Selzman. עבודה זו נתמכה גם בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות לימפומה נבג המענק P50CA126752 וNIH R01 DK093660.

יום 0 1. בידוד של PBMCs דם אנושי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 20 מ&quot;ל של דם אדם טרי באמצעות venipuncture לתוך צינורות vacutainer Na-ההפרין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דם תערובת והמתקדמת RPMI 1640 ב1:1 (v / v) יחס. </li><li style=";text-align:righ...

<ol>
	<li>Cary, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mutagenesis+of+baculoviruses:+analysis+of+Trichoplusia+ni+transposon+IFP2+insertions+within+the+FP-locus+of+nuclear+polyhedrosis+viruses.">Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.</a> Virology. 172 (1), 156 (1989).</li><li>Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+movement+of+Lepidopteran+transposon+IFP2+in+insect+cells+using+a+baculovirus+genome+as+a+target+DNA.">Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA.</a> Virology. 211 (2), 397 (1995).</li><li>Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+piggyBac+(PB)+transposon+in+mammalian+cells+and+mice.">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473 (2005).</li><li>Saridey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+transposon-based+inducible+gene+expression+in+vivo+after+somatic+cell+gene+transfer.">PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer.</a> Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).</li><li>Nakanishi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon-mediated+long-term+gene+expression+in+mice.">piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice.</a> Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).</li><li>Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+Transposon-mediated+Gene+Transfer+in+Human+Cells.">PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells.</a> Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).</li><li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+PiggyBac+transposon+system+for+the+sustained+genetic+modification+of+human+T+lymphocytes.">Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes.</a> J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).</li><li>Raja Manuri, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon/transposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+treatment+of+B-lineage+malignancies.">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).</li><li>Doherty, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+piggyBac+gene+transfer+in+human+cells+and+in+vivo.">Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo.</a> Hum. Gene Ther. , (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).</li><li>Bonini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+T+cells.">Genetic modification of T cells.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).</li><li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon+and+transposase+system+for+human+application.">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).</li><li>Galvan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+PiggyBac+transposon+integrations+in+primary+human+T+cells.">Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells.</a> J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).</li><li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac-Mediated+Cancer+Immunotherapy+Using+EBV-Specific+Cytotoxic+T-Cells+Expressing+HER2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor.">PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).</li><li>Huye, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+mTor+Inhibitors+With+Rapamycin-resistant+T+Cells:+A+Two-pronged+Approach+to+Tumor+Elimination.">Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).</li><li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+(G-Rex).">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).</li><li>Kahlig, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells.">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).</li></ol>

השיטה המתוארת כאן מאפשרת שינוי transgene יציב של לימפוציטים מסוג T האנושי ראשוני. בדקנו את השימוש במערכת transposon piggyBac עבר לשנות תאי T להביע גן כתב (יותר מ 4 שבועות), גן התאבדות אינו immunogenic, קולט אנטיגן chimeric לחיסון מאמצת (ליותר מ 100 ימים), ולהנדס התנגדות לתרופות מדכאות חיסון ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Lympholyte </td><td> Cedarlane </td><td> CL5015 </td><td></td></tr><tr><td> המתקדם RPMI 1640 </td><td> LifeTechnologies </td><td> 12633020 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי Hyclone </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> SH3008803 </td><td></td></tr><tr><td> מוסף GlutaMAX- </td><td> LifeTechnologies </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> IL-15 אנוש חלבון רקומביננטי </td><td> eBioscience </td><td> 14-8159 </td><td></td></tr><tr><td> קיט מקסי פלסמיד EndoFree </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001S </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> תאי T אנושי Nucleofector קיט </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CD8-APC </td><td> דרום יוטק </td><td> 9536-11 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD3 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0037-81 </td><td></td></tr><tr><td> CD28 אנטי אנושי </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555725 </td><td></td></tr><tr><td> פלייט מטפל בתרביות רקמה 24 ובכן </td><td> BD פלקון </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> תרבית רקמה טובה ללא 24 מטופלי פלייט </td><td> BD פלקון </td><td> 351147 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> תא T מלא מדיה רכב 1x המתקדם RPMI 1640 5% בסרום שור עוברי מומת חום 2 מ&quot;מ GlutamaxIM- </td></tr></tbody></table>

piggybac transposon system modification of primary human t cells

מערכת transposon piggyBac היא טבעי פעילה, המופק ממקור 1,2 כרוב Looper העש. מערכת שאינה נגיפית זה פלסמיד מבוסס, בדרך כלל ניצול שני פלסמידים עם אחד המבטא את אנזים transposase piggyBac וtransposon פלסמיד מטפח את הגן (ים) של עניין בין אלמנטים חוזרים הפוכים אשר נדרשים לפעילות העברת גנים. העברת גנים מתווך PiggyBac דרך מנגנון &quot;גזור ודבק&quot; לפי transposase משלב קטע transposon לתוך הגנום של תא המטרה (הים) של עניין. PiggyBac הוכיח פעילות מסירת גן יעילה במגוון רחב של חרקי 1,2, 3-5 יונקים, ו אדם cells6 לרבות תאי T אנושיים ראשוניים 7,8. לאחרונה, transposase piggyBac היפראקטיבי נוצר שיפור יעילות העברת גני 9,10. תאי T של אדם הם intere הקלינירח לחיסון מאמצת של 11 סרטן. מן ראוי לציין כי הניסוי הקליני הראשון הכולל שינוי transposon של תאי T אנושיים המשתמשים במערכת transposon היפיפייה הנרדמת אושר 12. יש לנו הערכה בעבר את השירות של piggyBac כהמתודולוגיה שאינה נגיפית הנדסה גנטית של תאי T אנושיים. מצאנו piggyBac להיות יעיל בשינוי הגנטי של תאי T אנושיים עם גן כתב וגן ההתאבדות מושרה אינו immunogenic 7. ניתוח של אתרי אינטגרציה הגנומי חשף חוסר ההעדפה להשתלבות או ליד אונקוגנים פרוטו ידוע 13. אנחנו השתמשנו piggyBac לימפוציטים גנים לשנות ציטוטוקסיות T לבצע קולט אנטיגן chimeric מופנה כנגד אנטיגן גידול HER2, וגילינו כי תאים ששונו גנטי T מתווכים סיכול ממוקדים של תאי גידול מסוג HER2 חיוביים במבחנת in vivo במודל עכבר orthotopic 14. השתמשנו גם piggyBacכדי לייצר תאי T אנושיים עמידים לrapamycin, אשר אמור להיות יעילים בטיפול בסרטן שבי rapamycin מנוצל 15. בזאת, אנו מתארים שיטה לשימוש piggyBac גנטי כדי לשנות את תאי T אנושיים ראשוניים. זה כולל בידוד של תאי דם היקפיים (mononuclear PBMCs) מדם של בני אדם ואחריו תרבות, שינוי גנטי, והפעלת תאי טי. לצורך הדו&quot;ח זה, תאי T שונו עם גן כתב (eGFP) לניתוח וכימות של ביטוי גנים על ידי cytometry זרימה. PiggyBac ניתן להשתמש כדי לשנות את תאי T אנושיים עם מגוון רחב של גנים של עניין. למרות שיש לנו להשתמש piggyBac לכוון תאי T לאנטיגנים סרטניים 14, יש לנו גם בשימוש piggyBac להוסיף מתג בטיחות מושרה על מנת לחסל תאים מהונדסים גנטיים במידת צורך 7. קיבולת המטען הגדולה של piggyBac גם אפשרה העברת גנים שלמולקולה גדולה rapamycin עמיד mTOR (15 ק&quot;ג) 15. לכן, אנו מציגים מתודולוגיה שאינה נגיפית לגני שינוי יציב של תאי T האנושיים ראשוניים למגוון רחב של מטרות.

סכמטי להדגים את השלבים בשינוי תאי T אנושיים עם גן כתב (eGFP) הגנטי מוצג באיור 1. פלסמידים אלה זמינים על פי בקשה מהמחברים. Schemtic מדגים את השלבים בלימפוציטים מסוג T האנושי מהונדס גנטי עם גן כתב (eGFP) הוא showin באיור 2. זה הכרחי להפעלת תאי T על מנת לקבל אותם להתחלק,...

Watch this Scientific Journal Video about piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells at JoVE.com

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

אנו מתארים שיטה גנטית כדי לשנות את תאי T אנושיים ראשוניים עם transgene שימוש שאינו ויראלי<em&gt; PiggyBac</em&gt; מערכת transposon. תאי T שונים לשימוש<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposon ביטוי transgene מערכת תערוכה יציב.

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

קביעת פעילות ציטוטוקסית אופטימלית של CD8 תאי T ספציפי אדם Her2neu על ידי השוואת Assay שחרור Cr51 למערכת xCELLigence

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; שימוש מיני<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesis תיווך transposon מרינר

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

הערכה של מאפייני המערכת החיסוניים של תאי גזע mesenchymal האדם (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

רצף מקביל בתפוקה גבוהה כדי כושר מדד לזיהום Leptospira interrogans Transposon ההכנסה מוטציות במהלך הזהב הסורי אוגר

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...