Name: piggybac transposon system modification of primary human t cells
Uploaded: 2012-11-05T12:00:00
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SSはTBMMプログラムを通じて卒業生のトレーニンググラントにHHMIメッドによって部分的にサポートされています。厚生省は、退役軍人省からキャリア開発賞と博士夫妻ハロルド·M·Selzmanの寛大な支援によって部分的にサポートされています。この作品はまた、NIHリンパ腫SPORE助成P50CA126752とNIH R01 DK093660によって部分的にサポートされていました。

0日目 1。ヒト血液由来のPBMCの分離<ol><li> Na型ヘパリンバキュテイナチューブに静脈穿刺を用いて新鮮なヒト血液20mlを採取します。 </li><li> 1:1（v / v）の割合でミックス血液およびAdvanced RPMI 1640。 </li><li> 50ml遠心チューブ（25℃）に20ミリリットルlymphoprep媒体を追加します。 lymphoprepの上に血のRPMI 1640ミックスのゆっくり層25〜30ミリリットル。 </li><li>ブレーキなしで40分間?...

<ol>
	<li>Cary, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mutagenesis+of+baculoviruses:+analysis+of+Trichoplusia+ni+transposon+IFP2+insertions+within+the+FP-locus+of+nuclear+polyhedrosis+viruses.">Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.</a> Virology. 172 (1), 156 (1989).</li><li>Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+movement+of+Lepidopteran+transposon+IFP2+in+insect+cells+using+a+baculovirus+genome+as+a+target+DNA.">Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA.</a> Virology. 211 (2), 397 (1995).</li><li>Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+piggyBac+(PB)+transposon+in+mammalian+cells+and+mice.">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473 (2005).</li><li>Saridey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+transposon-based+inducible+gene+expression+in+vivo+after+somatic+cell+gene+transfer.">PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer.</a> Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).</li><li>Nakanishi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon-mediated+long-term+gene+expression+in+mice.">piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice.</a> Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).</li><li>Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+Transposon-mediated+Gene+Transfer+in+Human+Cells.">PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells.</a> Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).</li><li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+PiggyBac+transposon+system+for+the+sustained+genetic+modification+of+human+T+lymphocytes.">Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes.</a> J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).</li><li>Raja Manuri, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon/transposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+treatment+of+B-lineage+malignancies.">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).</li><li>Doherty, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+piggyBac+gene+transfer+in+human+cells+and+in+vivo.">Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo.</a> Hum. Gene Ther. , (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).</li><li>Bonini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+T+cells.">Genetic modification of T cells.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).</li><li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon+and+transposase+system+for+human+application.">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).</li><li>Galvan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+PiggyBac+transposon+integrations+in+primary+human+T+cells.">Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells.</a> J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).</li><li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac-Mediated+Cancer+Immunotherapy+Using+EBV-Specific+Cytotoxic+T-Cells+Expressing+HER2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor.">PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).</li><li>Huye, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+mTor+Inhibitors+With+Rapamycin-resistant+T+Cells:+A+Two-pronged+Approach+to+Tumor+Elimination.">Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).</li><li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+(G-Rex).">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).</li><li>Kahlig, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells.">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).</li></ol>

本明細書に記載の方法は、一次ヒトTリンパ球の安定した導入遺伝子の改変を可能にします。我々は以前に、レポーター遺伝子（4週間以上）、非免疫原性の自殺遺伝子、養子免疫療法のためのキメラ抗原受容体（100日以上）を発現するT細胞を変更するpiggyBacトランスポゾンシステムの使用をテストしたと免疫抑制薬7,13-15に対する耐性をエンジニアに。養子免疫療法と他のアプ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> Lympholyte </td><td> Cedarlane </td><td> CL5015 </td><td></td></tr><tr><td>高度なRPMI 1640 </td><td> LifeTechnologies </td><td> 12633020 </td><td></td></tr><tr><td>ハイクローンウシ胎児血清</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> SH3008803 </td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス-Iサプリメント</td><td> LifeTechnologies </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトIL-15組換えタンパク質</td><td> eBioscience社</td><td> 14から8159 </td><td></td></tr><tr><td> EndoFreeプラスミドマキシキット</td><td>キアゲン</td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Amaxaヌクレオ</td><td>ロンザ</td><td> AAD-1001S </td><td> ＆NBSPは、 </td></tr><tr><td>ヒトT細胞ヌクレオキット</td><td>ロンザ</td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CD8-APC </td><td>サザンバイオテクノロジー</td><td> 9536から11 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD3 </td><td> eBioscience社</td><td> 16-0037-81 </td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD28 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 555725 </td><td></td></tr><tr><td> 24ウェル組織培養処理プレート</td><td> BDファルコン</td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td>プレート処理された24ウェル非組織培養</td><td> BDファルコン</td><td> 351147 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 完全なT細胞培地組成 1X高度RPMI 1640 5％の熱不活性化ウシ胎児血清 2mMのGlutamaxIM-I </td></tr></tbody></table>

piggybac transposon system modification of primary human t cells

piggyBacトランスポゾンシステムはもともとキャベツルーパー蛾1,2から派生した、自然にアクティブになります。この非ウイルス系は、最も一般的に1はpiggyBacトランスポサーゼ酵素と遺伝子導入活性に必要な逆方向反復要素の間に目的の遺伝子（複数可）を保有するプラスミド、トランスポゾンを発現する2つのプラスミドを利用して、ベースのプラスミドである。PiggyBacを媒介遺伝子転移は通っトランスポザーゼは、目的の標的細胞（S）のゲノムにトランスポゾンセグメントを統合することにより&quot;カット＆ペースト&quot;メカニズムは。PiggyBacは 3-5哺乳類昆虫1,2、多種多様で効率的な遺伝子送達活性を示した、としているプライマリーヒトT細胞を含むヒトの7,8 cells6。最近では、非常に活発piggyBacのトランスポザーゼは、遺伝子導入効率を向上させる9,10生成されました。 ヒトTリンパ球は、臨床intereであるがん11の養子免疫療法のst。注目すべきは、 眠れる森の美女のトランスポゾンシステムを用いて、ヒトT細胞のトランスポゾンの修正を含む最初の臨床試験は、12を承認されています。我々は以前に、ヒトT細胞の遺伝子改変のための非ウイルス性の方法論としてpiggyBacの有用性を評価した。我々は、レポーター遺伝子と非免疫原性誘導自殺遺伝子7とヒトT細胞の遺伝子改変で効率的であることがpiggyBac発見。ゲノム組み込み部位の解析では、既知の癌原遺伝子13内又はその付近の統合のための好みの欠如を明らかにした。我々は、腫瘍抗原、HER2に対して向けられたキメラ抗原受容体を運ぶために細胞傷害性Tリンパ球の遺伝子変更するpiggyBac使用され、遺伝子改変T細胞は、同所性マウスモデルにおいて、in vitroおよび in vivo でのHER2陽性腫瘍細胞の死滅標的媒介ことがわかった14。我々はまた、piggyBacを使用していたラパマイシンは15を利用されている癌治療に有用であるはずであるラパマイシンに耐性のヒトT細胞を生成します。 ここで、我々は、遺伝的に一次ヒトT細胞を変更するpiggyBacを使用するための方法を説明します。これは、文化、遺伝子改変し、T細胞の活性化に続いてヒト血液から末梢血単核細胞（PBMC）の単離を含む。このレポートの目的は、T細胞は、フローサイトメトリーによる遺伝子発現の解析と定量化のためのレポーター遺伝子（EGFP）で修飾した。 PiggyBacは、関心のある遺伝子の様々なヒトT細胞を変更するために使用することができます。我々は腫瘍抗原14〜T細胞に指示するpiggyBac使用しましたが、我々はまた、7を必要に応じて遺伝子改変された細胞を排除するために、誘導の安全スイッチを追加するpiggyBac使用しています。 piggyBacの大型貨物の容量も遺伝子導入が可能になりました大ラパマイシン耐性のmTOR分子（15キロバイト）15。したがって、我々は様々な目的のための主要なヒトT細胞の安定した遺伝子改変のための非ウイルス性の方法論を提示する。

遺伝的にレポーター遺伝子（EGFP）を有するヒトTリンパ球を変更するの手順を示す模式図を図1に示します。これらのプラスミドは、著者からのリクエストも承ります。レポーター遺伝子（EGFP）を遺伝的に改変されたヒトTリンパ球の手順を実演schemticは、 図2のshowinです。それは彼らが、分割展開し、文化に伝播するように取得するために、T細胞を活性化...

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piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

我々は、遺伝的に非ウイルスを用いて導入遺伝子を持つプライマリヒトT細胞を変更する方法を説明します<em&gt; piggyBac</em&gt;トランスポゾンシステム。 T細胞は、使用して変更された<em&gt; piggyBac</em&gt;トランスポゾンシステムは安定した導入遺伝子の発現を示す。

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

ゾレドロネートを使用してヒト末梢血γδT細胞の拡大

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

xCELLigenceシステムにCR51リリースアッセイを比較することによって、人間Her2neu特異的CD8 T細胞の最適な細胞傷害活性を決定する

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

アルギン酸塩産生に関連する新規遺伝子の同定<em&gt;緑膿菌</em使用&gt;ミニ<em&gt; himar1</em&gt;マリナートランスポゾンによる突然変異誘発

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

末梢血からのヒトアロ抗原特異的T細胞の生成

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

ヒト間葉系幹細胞（MSC）の免疫調節特性の評価

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

ヒト子宮頸管ガンマ・デルタT細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

レプトスピラトランスポゾン挿入変異体中に黄金シリアのハムスター感染の測定フィットネスにハイスループット並列配列

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタ フェースの評価

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...