Name: piggybac transposon system modification of primary human t cells
Uploaded: 2012-11-05T12:00:00
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SS é apoiado em parte pela Med HHMI em Grad Formação Grant através do Programa TBMM. MHW é suportado, em parte, por um prêmio de desenvolvimento de carreira do Departamento de Assuntos de Veteranos eo generoso apoio do Dr. Harold e Sra. M. Selzman. Este trabalho também foi apoiado em parte por linfoma NIH SPORE concessão P50CA126752 e R01 NIH DK093660.

Dia 0 1. Isolamento de PBMCs a partir de Sangue Humano <ol><li> Recolher 20 ml de sangue humano fresco, utilizando a punção venosa em tubos Vacutainer Na-heparina. </li><li> Mix de sangue e Avançado RPMI 1640 em 01:01 (v / v) a relação. </li><li> Adicionam-se 20 ml de meio de Lymphoprep num tubo de centrifugação de 50 ml (25 ° C). Lentamente camada 25-30 ml de RPMI-1640 de sangue mistura no topo da Lymphoprep. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 40 min sem freios. </li><li> Recolhe...

<ol>
	<li>Cary, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mutagenesis+of+baculoviruses:+analysis+of+Trichoplusia+ni+transposon+IFP2+insertions+within+the+FP-locus+of+nuclear+polyhedrosis+viruses.">Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.</a> Virology. 172 (1), 156 (1989).</li><li>Fraser, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+Transposon-mediated+Gene+Transfer+in+Human+Cells.">PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells.</a> Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).</li><li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+PiggyBac+transposon+system+for+the+sustained+genetic+modification+of+human+T+lymphocytes.">Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes.</a> J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).</li><li>Raja Manuri, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon/transposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+treatment+of+B-lineage+malignancies.">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).</li><li>Doherty, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+piggyBac+gene+transfer+in+human+cells+and+in+vivo.">Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo.</a> Hum. Gene Ther. , (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).</li><li>Bonini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+T+cells.">Genetic modification of T cells.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).</li><li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon+and+transposase+system+for+human+application.">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).</li><li>Galvan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+PiggyBac+transposon+integrations+in+primary+human+T+cells.">Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells.</a> J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).</li><li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac-Mediated+Cancer+Immunotherapy+Using+EBV-Specific+Cytotoxic+T-Cells+Expressing+HER2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor.">PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).</li><li>Huye, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+mTor+Inhibitors+With+Rapamycin-resistant+T+Cells:+A+Two-pronged+Approach+to+Tumor+Elimination.">Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).</li><li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+(G-Rex).">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).</li><li>Kahlig, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells.">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).</li></ol>

O método aqui descrito permite a modificação de transgene estável primárias linfócitos T humanos. Temos anteriormente testado o uso do sistema de transposon piggyBac para modificar as células T para expressar um gene repórter (por mais de 4 semanas), um gene suicida não imunogénica, um receptor do antigénio quimérico para uma imunoterapia adoptiva (por mais de 100 dias), e de projetar a resistência a medicamentos imunossupressores 7,13-15. Non-viral modificação de células T para a imu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Lympholyte </td><td> Cedarlane </td><td> CL5015 </td><td></td></tr><tr><td> Avançado RPMI 1640 </td><td> LifeTechnologies </td><td> 12633020 </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino Hyclone </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3008803 </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX-I Suplemento </td><td> LifeTechnologies </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> IL-15 humana recombinante Protein </td><td> eBioscience </td><td> 14-8159 </td><td></td></tr><tr><td> EndoFree Plasmid Maxi Kit </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001S </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Human T Cell do Nucleofector Kit </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CD8-APC </td><td> Southern Biotech </td><td> 9536-11 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD3 Humano </td><td> eBioscience </td><td> 16-0037-81 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD28 humano </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555725 </td><td></td></tr><tr><td> Placa 24 Cultura de Tecidos Bem tratada </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Cultura de Tecidos Bem Não Tratada Placa </td><td> BD Falcon </td><td> 351147 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Completa de células T mídia composição 1x avançada RPMI 1640 5% de calor soro bovino fetal inactivado 2 mM GlutamaxIM-I </td></tr></tbody></table>

piggybac transposon system modification of primary human t cells

O piggyBac sistema transposon é naturalmente ativo, originalmente derivado da 1,2 repolho traça looper. Este sistema não-viral é o plasmídeo com base, mais comumente utilizando dois plasmídeos com uma expressão da enzima transposase piggyBac e um transposon plasmídeo que alberga o gene (s) de interesse entre os elementos de repetição invertidos, que são necessários para a actividade de transferência de genes. PiggyBac medeia a transferência de genes através um &quot;corta e cola&quot; o mecanismo através do qual se integra o segmento transposase do transposão no genoma da célula alvo (s) de interesse. piggyBac demonstrou actividade a entrega eficiente de genes em uma ampla variedade de 1,2 insectos, mamíferos 3-5, e humana cells6 incluindo células T primárias humanos 7,8. Recentemente, uma transposase piggyBac hiperactivo foi gerada a melhoria da eficiência de transferência de genes 9,10. Os linfócitos T humanos são de intere clínicoª para a imunoterapia adoptiva de câncer 11. De nota, o primeiro ensaio clínico envolvendo transposon modificação de células T humanas utilizando o sistema de transposon Sleeping beauty foi aprovado 12. Temos anteriormente avaliaram a utilidade de piggyBac como metodologia não virais para a modificação genética de células T humanas. Encontrámos piggyBac ser eficientes na modificação genética de células T humanas com um gene repórter e um não-imunogénico gene suicida induzível 7. Análise de locais de integração genómicos revelou uma falta de preferência para integração em ou perto de proto-oncogenes conhecidos 13. Usamos a piggyBac gene-modificam linfócitos T citotóxicos para transportar um receptor do antigénio quimérico dirigido contra o antigénio de tumor HER2, e descobriram que as células T modificadas gene-alvo mediada por morte de HER2-positivos de células tumorais in vitro e in vivo num modelo de rato ortotópico 14. Temos também utilizado piggyBacpara gerar células T humanas resistentes a rapamicina, que devem ser úteis em terapias de cancro em que a rapamicina é utilizada 15. Relata-se um método para utilizar piggyBac para modificar geneticamente células T primárias humanas. Isto inclui o isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) a partir de sangue humano, seguido por cultura, a modificação do gene, e a activação das células T. Para efeitos do presente relatório, as células T foram modificados com um gene repórter (eGFP), para análise e quantificação da expressão de genes através de citometria de fluxo. PiggyBac pode ser usado para modificar células T humanas com uma variedade de genes de interesse. Apesar de termos usados ​​piggyBac para dirigir as células T a antigénios de tumor 14, também foram utilizados piggyBac para adicionar um interruptor de segurança induzível de modo a eliminar as células de genes modificados, se necessário 7. A capacidade de carga de grande piggyBac também permitiu a transferência de genes deuma grande molécula de rapamicina mTOR resistente (15 kb) 15. Por conseguinte, apresenta-se uma metodologia não-viral para estável gene modificação de células T primárias humanas para uma grande variedade de finalidades.

Um diagrama esquemático mostrando as etapas na modificação genética de linfócitos T humanos com um gene repórter (eGFP) é mostrado na Figura 1. Estes plasmídeos estão disponíveis mediante solicitação dos autores. A schemtic demonstrando as etapas geneticamente modificados linfócitos T humanos com um gene repórter (eGFP) é showin na Figura 2. É necessário para activar as células T, a fim de levá-los a dividir, expandir e propagar em cultura. Modificados células T huma...

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piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Descreve-se um método para modificar geneticamente células T primárias humanas com um transgene, utilizando o não-viral<em&gt; PiggyBac</em&gt; Sistema de transposon. As células T modificado para utilizar o<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposon sistema mostra a expressão do transgene estável.

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Expansão do sangue periférico humano γδ células T usando zoledronato

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Imunologia e Infecção

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence

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Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

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Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

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Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

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Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

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Identificação de novos genes associados com alginato de Produção em<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Usando Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagênese Mariner Transposon mediada

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The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

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Elevado-throughput sequenciamento paralela à medida Fitness de Leptospira interrogans Transposon inserção mutantes durante a Golden sírio Hamster infecção

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

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