Name: piggybac transposon system modification of primary human t cells
Uploaded: 2012-11-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells at JoVE.com

SS stöds delvis av HHMI Med i Grad Training Grant genom TBMM programmet. MHW stöds delvis av en karriärutveckling utmärkelse från Department of Veterans Affairs och generöst stöd av Dr och Mrs Harold M. Selzman. Detta arbete stöddes också delvis av NIH lymfom SPORE bidraget P50CA126752 och NIH R01 DK093660.

Dag 0 1. Isolering av PBMC från humant blod <ol><li> Samla 20 ml färskt humant blod med användning av venpunktion i Na-heparin vacutainerrör. </li><li> Blanda blod och avancerad RPMI 1640 i 1:1 (v / v) förhållande. </li><li> Tillsätt 20 ml Lymphoprep medium till en 50 ml centrifugrör (25 ° C). Långsamt skikt 25-30 ml blod-RPMI 1.640 blandning ovanpå Lymfoprep. </li><li> Centrifugera vid 400 xg under 40 min utan bromsar. </li><li> Samla både distinkta och fuzzy skikt med en engång...

<ol>
	<li>Cary, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mutagenesis+of+baculoviruses:+analysis+of+Trichoplusia+ni+transposon+IFP2+insertions+within+the+FP-locus+of+nuclear+polyhedrosis+viruses.">Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.</a> Virology. 172 (1), 156 (1989).</li><li>Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+movement+of+Lepidopteran+transposon+IFP2+in+insect+cells+using+a+baculovirus+genome+as+a+target+DNA.">Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA.</a> Virology. 211 (2), 397 (1995).</li><li>Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+piggyBac+(PB)+transposon+in+mammalian+cells+and+mice.">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473 (2005).</li><li>Saridey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+transposon-based+inducible+gene+expression+in+vivo+after+somatic+cell+gene+transfer.">PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer.</a> Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).</li><li>Nakanishi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon-mediated+long-term+gene+expression+in+mice.">piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice.</a> Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).</li><li>Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+Transposon-mediated+Gene+Transfer+in+Human+Cells.">PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells.</a> Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).</li><li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+PiggyBac+transposon+system+for+the+sustained+genetic+modification+of+human+T+lymphocytes.">Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes.</a> J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).</li><li>Raja Manuri, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon/transposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+treatment+of+B-lineage+malignancies.">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).</li><li>Doherty, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+piggyBac+gene+transfer+in+human+cells+and+in+vivo.">Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo.</a> Hum. Gene Ther. , (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).</li><li>Bonini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+T+cells.">Genetic modification of T cells.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).</li><li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon+and+transposase+system+for+human+application.">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).</li><li>Galvan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+PiggyBac+transposon+integrations+in+primary+human+T+cells.">Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells.</a> J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).</li><li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac-Mediated+Cancer+Immunotherapy+Using+EBV-Specific+Cytotoxic+T-Cells+Expressing+HER2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor.">PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).</li><li>Huye, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+mTor+Inhibitors+With+Rapamycin-resistant+T+Cells:+A+Two-pronged+Approach+to+Tumor+Elimination.">Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).</li><li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+(G-Rex).">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).</li><li>Kahlig, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells.">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).</li></ol>

Den metod som beskrivs häri möjliggör stabil transgen modifiering av primära humana T-lymfocyter. Vi har tidigare testat användningen av piggyBac transposonen systemet att modifiera T-celler att uttrycka en reportergen (mer än 4 veckor), en icke-immunogen självmord gen, en chimär antigen receptor för adoptiv immunterapi (mer än 100 dagar), och ingenjör motstånd mot immunsuppressiva läkemedel 7,13-15. Icke-virala modifiering av T-celler för adoptiv immunterapi och andra applikationer bö...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> Lympholyte </td><td> Cedarlane </td><td> CL5015 </td><td></td></tr><tr><td> Avancerad RPMI 1640 </td><td> LifeTechnologies </td><td> 12633020 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone fetalt bovint serum </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3008803 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-I Tillägg </td><td> LifeTechnologies </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> Humant IL-15 rekombinant protein </td><td> eBioscience </td><td> 14-8159 </td><td></td></tr><tr><td> EndoFree Plasmid Maxi Kit </td><td> Qiagen </td><td> 12.362 </td><td></td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001S </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Human T-cell Nucleofector Kit </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CD8-APC </td><td> Southern Biotech </td><td> 9536-11 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humant CD3 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0037-81 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human CD28 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555.725 </td><td></td></tr><tr><td> 24 brunnars vävnadsodlingsplatta behandlad Plate </td><td> BD Falcon </td><td> 353.047 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Väl Icke Tissue Culture Plate Behandlat </td><td> BD Falcon </td><td> 351.147 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Komplett T-cell media komposition 1x Avancerad RPMI 1640 5% värmeinaktiverat fetalt bovint serum 2 mM GlutamaxIM-I </td></tr></tbody></table>

piggybac transposon system modification of primary human t cells

Det piggyBac transposon systemet är naturligt aktiva, ursprungligen härrör från kål griparen mal 1,2. Denna icke-viralt system är plasmiden baserad, vanligast använda två plasmider med en uttrycker piggyBac transposaset enzymet och en transposon-plasmid hyser genen (generna) av intresse mellan inverterade repetetiva element som krävs för genöverföring aktivitet. PiggyBac förmedlar genöverföring genom en &quot;klippa och klistra&quot;-mekanism varigenom transposaset integrerar transposonen segmentet i genomet hos målcellen (er) av intresse. PiggyBac har visat effektiv aktivitet gentillförsel i en mängd olika insekter 1,2, däggdjurs 3-5, och mänskliga cells6 inklusive primära humana T-celler 7,8. Nyligen har en hyperaktiv piggyBac transposas genereras effektivisering genöverföring 9,10. Humana T-lymfocyter är av klinisk interest för adoptiv immunterapi av cancer 11. Att notera, har den första kliniska studie med transposon modifiering av humana T-celler med hjälp av Sleeping Beauty transposon godkänts 12. Vi har tidigare utvärderat användbarheten av piggyBac som en icke-viral metodik för genetisk modifiering av mänskliga T-celler. Vi hittade piggyBac att vara effektiv i genetisk modifiering av mänskliga T-celler med en reportergen och en icke-immunogen inducerbar självmordsgen 7. Analys av genomiska integrationsställen avslöjade en brist på preferens för integration i eller nära kända proto-onkogener 13. Vi använde piggyBac till gen-modifiera cytotoxiska T-lymfocyter att bära en chimär antigenreceptor riktad mot tumörantigenet HER2, och fann att gen-modifierade T-celler medierad riktade dödande av HER2-positiva tumörceller in vitro och in vivo i ett ortotopisk musmodell 14. Vi har också använt piggyBacatt generera humana T-celler resistenta mot rapamycin, som bör vara användbara i cancerterapier där rapamycin används 15. Häri beskriver vi en metod för att använda piggyBac att genetiskt modifiera primära humana T-celler. Detta inbegriper isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMC) från humant blod, följt av odling, genmodifiering, och aktivering av T-celler. Vid tillämpningen av denna rapport har T-celler modifierade med en reportergen (EGFP) för analys och kvantifiering av genuttryck genom flödescytometri. PiggyBac kan användas för att modifiera humana T-celler med en mängd olika gener av intresse. Även om vi har använt piggyBac att styra T-celler till tumörantigener 14 har vi också använt piggyBac att lägga till en switch inducerbart säkerhet för att eliminera genmodifierade celler om det behövs 7. Den stora lastkapacitet på piggyBac har också gjort det möjligt genöverföring aven stor rapamycin resistent mTOR molekyl (15 kb) 15. Därför presenterar vi en icke-viral metod för stabil gen-modifiering av primära humana T-celler för en mängd olika syften.

En schematisk visar stegen i genetiskt modifiera humana T-lymfocyter med en reportergen (EGFP) visas i figur 1. Dessa plasmider finns tillgängliga på begäran från författarna. En schemtic visar stegen i genetiskt modifierade humana T-lymfocyter med en reportergen (EGFP) är showin i figur 2. Det är nödvändigt att aktivera T-celler för att få dem att dela, expandera och propagera i kultur. Modifierade humana T-celler odlades sedan och analyserades med användning av flödescyto...

Watch this Scientific Journal Video about piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells at JoVE.com

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Vi beskriver ett förfarande för att genetiskt modifiera primära humana T-celler med en transgen med det icke-virala<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposon systemet. T-celler modifierade för att använda<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposon-system uppvisar stabilt transgenexpression.

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Utbyggnad av Human Peripheral Blood γδ T-celler med hjälp zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Att avgöra den optimala cytotoxiska aktiviteten hos mänskliga Her2neu specifika CD8 T-celler genom att jämföra Cr51 frisättningsanalysen till xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering av Inducerade regulatoriska T-celler från primära humana naiva och minne T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Bedömning av Innate Sensing av HIV-1 infekterade CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler från Plasmacytoid dendritiska celler med en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Samodlingssystemet.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identifiering av nya gener associerade med alginat Produktion i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Med hjälp av Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon mutagenes

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generering av Human Alloantigen-specifika T-celler från perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

Bedömning av immunmodulerande egenskaper av humana mesenkymala stamceller (MSC: er)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolering och flödescytometrisk analys av Human Endocervikala Gamma Delta T-celler

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

Hög genomströmning parallella sekvensering att mäta konditionen av Leptospira interrogans Transposon införande mutanter under gyllene syriska Hamster infektion

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Bedömning av Synaptic gränssnittet för primära humant T-celler från perifert blod och lymfatisk vävnad

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...