Name: measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes
Uploaded: 2013-03-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Sonderforschungsbereich TransRegio 19 (SFB/TR19, C2) van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), het federale ministerie van Economie en Technologie project ZIM-KF 2727801MD0 en het Centrum voor Innovatie Competence - humorale immuunresponsen in Hart-en vaatziekten ( ZIK-HIKE, BMBF FKZ 03Z2CN12) van het ministerie van Onderwijs en Onderzoek, Duitsland. Huisvesting en experimenten met dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Vereniging voor Proefdierkunde (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) en de Federatie van Europese Laboratory Animal Science Association (FELASA).

1. IgG Isolatie uit monsters van patiënten <ol><li> Bereid mini-immunoadsorptie kolommen door het invullen van 3 ml anti-IgG sepharose per 2 ml patiënt EDTA plasma in een lege Econo Pac kolom. IgG isolatie vereist ten minste 2 ml van de patiënt plasma. </li><li> Plaats een filter bovenop de anti-IgG sepharose, opengesneden het laagste punt van de kolom en druk het een debiet van ongeveer 1 druppel / sec bereiken. Laat de preservatievloeistof opraken van de kolom. </li><li> Was de kolom met 3 volumes 0,9% NaCl per v...

<ol>
	<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (4), e18 (2011).</li><li>Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-heart+autoantibodies+in+familial+dilated+cardiomyopathy.">Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy.</a> Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+mechanisms+underlying+dilated+cardiomyopathy.">Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy.</a> Circ. J. 73 (4), 602 (2009).</li><li>Felix, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+effects+of+immunoadsorption+and+subsequent+immunoglobulin+substitution+in+dilated+cardiomyopathy:+Three-month+results+from+a+randomized+study.">Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).</li><li>Staudt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+immunoglobulin+G3+subclass+in+dilated+cardiomyopathy:+results+from+protein+A+immunoadsorption.">Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption.</a> Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).</li><li>Nikolaev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorescence+method+for+the+rapid+detection+of+functional+beta1-adrenergic+receptor+autoantibodies+in+heart+failure.">A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+activating+human+beta1-adrenergic+receptors+are+associated+with+reduced+cardiac+function+in+chronic+heart+failure.">Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure.</a> Circulation. 99 (5), 649 (1999).</li><li>Gocayne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+of+rat+cardiac+beta-adrenergic+and+muscarinic+cholinergic+receptors+obtained+by+automated+DNA+sequence+analysis:+further+evidence+for+a+multigene+family.">Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).</li><li>Jaenicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+human+beta-myosin+heavy+chain+gene+and+a+comparative+analysis+of+its+product.">The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product.</a> Genomics. 8 (2), 194 (1990).</li><li>Piper, H. M., Volz, A., Schwartz, P., Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , (1990).</li><li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+endothelial+cells+remodel+cultured+adult+cardiomyocytes+and+increase+their+survival.">Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival.</a> Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).</li><li>Magnusson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.+Characterization+of+antibodies+against+the+beta+1-adrenoceptor+with+positive+chronotropic+effect.">Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect.</a> Circulation. 89 (6), 2760 (1994).</li><li>Wakefield, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+in+vitro+methods+to+safety+pharmacology.">The application of in vitro methods to safety pharmacology.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).</li><li>Kajzar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+physiological+conditions+for+cell+analyses:+forces+of+heart+muscle+cells+suspended+between+elastic+micropillars.">Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars.</a> Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).</li></ol>

De gepresenteerde methode biedt een geschikte manier om functioneel effectieve cardiale autoantilichamen te sporen bij patiënten met DCM van onduidelijke herkomst. In vergelijking met andere methoden, de detectie van functionele actieve antilichamen tegen de β1-adrenoceptor bijvoorbeeld door het effect op cAMP niveaus 6, onze methode is onafhankelijk van een specifiek epitoop. Natuurlijk zijn er andere epitoop onafhankelijke proeven in de literatuur beschreven, namelijk het tellen van de g...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens / apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Immunosorba preservatievloeistof </td><td> Fresenius Medical Care </td><td> 903609211 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase type 2 </td><td> Cell System </td><td> LS004176 </td><td></td></tr><tr><td> BSA, vrije vetzuur </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6003 </td><td></td></tr><tr><td> Laminine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0888 </td><td> 1 mg / ml in DMSO </td></tr><tr><td> Econo Pac chromatografiekolommen </td><td> BioRad </td><td> 732-1010 </td><td></td></tr><tr><td> Spectra / Por Biotech cellulose-ester Dialyse Membrane </td><td> Spectrumlabs </td><td> 131417 </td><td></td></tr><tr><td> 4 goed Chambered coverglass </td><td> Nunc </td><td> 155383 </td><td></td></tr><tr><td> Myocyten Calcium en contractiliteit opnamesysteem </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IonWizard 6,0 ​​analysesoftware </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes

Gedilateerde cardiomyopathie (DCM) is een van de belangrijkste oorzaken van hartfalen bij jongere volwassenen 1. Hoewel genetische aanleg en blootstelling aan toxische stoffen bekende oorzaken van deze ziekte bij ongeveer eenderde van de patiënten, de oorsprong van DCM grotendeels onduidelijk. In een groot aantal van deze patiënten hebben autoantilichamen tegen cardiale epitopen gedetecteerd en wordt vermoed een centrale rol spelen bij de ontwikkeling en progressie van de ziekte 2,3. Het belang van cardiale autoantilichamen wordt onderstreept door een hemodynamische verbetering waargenomen met DCM patiënten na verwijdering van auto-antistoffen door immunoadsorptie 3-5. Een verscheidenheid van specifieke antigenen zijn reeds geïdentificeerd 2,3 en antilichamen tegen deze targets worden gedetecteerd door immunoassays. Maar deze assays geen onderscheid maken tussen stimuleren (en dus functioneel effectief) en blokkeren autoantilichamen. Er steeds evidence dat dit onderscheid is cruciaal 6,7. Ook kan worden uitgegaan dat de targets voor een aantal cardiotropic antilichamen nog niet geïdentificeerd zijn en dus niet worden gedetecteerd door immunoassays. Daarom hebben we een methode voor de detectie van antilichamen functioneel actief cardiotropic, onafhankelijk van hun antigen. De achtergrond van de werkwijze is de hoge homologie meestal waargenomen voor functionele regio van cardiale eiwitten in zoogdieren tussen 8,9. Dit suggereert dat cardiale antilichamen gericht tegen humane antigenen zullen kruisreageren met niet-menselijke doelwitcellen die testen van IgG kunnen uit DCM patiënten volwassen cardiomyocyten van de rat. De methode bestaat uit drie stappen: eerst IgG geïsoleerd uit patiënten met plasma sepharose gekoppelde anti-IgG antilichamen verkregen uit immunoadsorptie kolom (PlasmaSelect, Teterow, Duitsland). Tweede volwassen hartspiercellen worden geïsoleerd door collagenase perfusie in een Langendorff perfusie inrichting met apROTOCOL gewijzigd ten opzichte van eerdere werken 10,11. De verkregen hartspiercellen zijn aan laminine beklede chambered coverglasses en gekleurd met Fura-2, een calcium-selectieve fluorescerende kleurstof die gemakkelijk kunnen worden gebracht in de cel om intracellulaire calcium nemen (Ca 2 +) inhoud 12. In de laatste stap, het effect van IgG patiënt op de cel verkorten en Ca 2 + transiënten van gebied gestimuleerde cardiomyocyten wordt online gevolgd met een commerciële myocyte calcium en contractiliteit controlesysteem (IonOptix, Milton, MA, USA) aan een standaard inverse fluorescent microscoop.

Twee voorbeelden voor het meten van cellulaire inotropie in veld gestimuleerde volwassen hartspiercellen (figuur 2) met een myocyte Ca 2 + en contractiliteit registratiesysteem worden hieronder gegeven. Figuur 3 geeft een indruk van een controlemeting, terwijl in figuur 4 de invloed van antilichamen cardiodepressieve van een patiënt met DCM getoond. In beide voorbeelden initiële cel bakvet en Ca 2 + transient tijdens ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes at JoVE.com

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

De onderhavige methode biedt een manier om functioneel effectieve cardiotropic auto-antilichamen te detecteren in het plasma van patiënten met gedilateerde cardiomyopathie, ongeacht de specifieke antigen, door analyse van het effect van geïsoleerde patiënt immunoglobuline op cellulaire verkorten en intracellulair calcium transiënten in geïsoleerde cardiomyocyten van de rat.

Meting van antilichaam Effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Meting van cytosolische Ca 2 + In geïsoleerde contractiele lymphatische

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Een Microplate Assay aan chemische Effecten op RBL-2H3 mestceldegranulatie Assess: Effecten van Triclosan, zonder gebruik van een organisch oplosmiddel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Het analyseren van de effecten van stromale cellen op de recrutering van leukocyten van Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometrische analyse van deeltjes gebonden Bet v 1 allergeen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Intraperitoneaal Glucose tolerantie Test, meting van de longfunctie, en fixatie van de longen om te bestuderen van de gevolgen van obesitas en verminderde stofwisseling op pulmonaire resultaten

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Beoordeling van antilichaam gebaseerde Drugs gevolgen voor lymfkliertest beenmerg en peritoneale Macrophage activering

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Een methode voor het meten van speekselklier functie in muizen

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...