Name: measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes
Uploaded: 2013-03-08T12:00:00
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Este trabalho foi financiado pela Transregio Sonderforschungsbereich 19 (SFB/TR19, C2) da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), o Ministério Federal da Economia e Tecnologia projeto ZIM-KF 2727801MD0 e do Centro de Competência Inovação - respostas imunes humoral em Doenças Cardiovasculares ( ZIK CAMINHADA, BMBF FKZ 03Z2CN12) do Ministério Federal da Educação e Pesquisa, na Alemanha. Habitação e experimentos com animais foram realizados de acordo com as recomendações da Sociedade para Laboratory Animal Science (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) e da Federação Europeia de Laboratório Animal Science Association (FELASA).

1. IgG isolamento de amostras de pacientes <ol><li> Prepare mini-colunas de imunoadsorção preenchendo 3 ml anti-IgG Sepharose por paciente 2 ml de EDTA plasma em um vazio coluna Econo Pac. IgG isolamento requer, pelo menos, 2 ml de plasma do paciente. </li><li> Colocar um filtro na parte superior da sefarose anti-IgG, cortou a ponta inferior da coluna e prima do filtro para atingir uma taxa de fluxo de cerca de 1 gota / seg. Deixe a solução de preservação correr para fora da coluna. </li><li> Lavar a coluna com ...

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	<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (4), e18 (2011).</li><li>Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-heart+autoantibodies+in+familial+dilated+cardiomyopathy.">Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy.</a> Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+mechanisms+underlying+dilated+cardiomyopathy.">Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy.</a> Circ. J. 73 (4), 602 (2009).</li><li>Felix, S. 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O método apresentado oferece um modo adequado, para detectar auto-anticorpos funcionalmente eficazes cardíacos em pacientes com DCM de origem incerta. Em comparação com os outros métodos, por exemplo, a detecção de anticorpos funcionais activos contra o β1-adrenérgico por seu impacto sobre os níveis de cAMP 6, o nosso método é independente de um epitopo específico. Claro que há outros epítopos ensaios independentes descritos na literatura, ou seja, a taxa de contagem de cardio...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Immunosorba solução de preservação </td><td> Fresenius Medical Care </td><td> 903609211 </td><td></td></tr><tr><td> A colagenase do tipo 2 </td><td> Sistema de célula </td><td> LS004176 </td><td></td></tr><tr><td> BSA, ácidos graxos livres </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6003 </td><td></td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-02:00 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0888 </td><td> 1 mg / ml em DMSO </td></tr><tr><td> Econo Pac colunas de cromatografia </td><td> BioRad </td><td> 732-1010 </td><td></td></tr><tr><td> Spectra / Por Biotech éster de celulose Diálise Membrane </td><td> Spectrumlabs </td><td> 131417 </td><td></td></tr><tr><td> 4 bem Chambered lamela </td><td> Nunc </td><td> 155383 </td><td></td></tr><tr><td> O cálcio dos miócitos e Sistema de Gravação Contratilidade </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IonWizard software de análise de 6,0 </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes

Cardiomiopatia dilatada (CMD) é uma das principais causas para a insuficiência cardíaca em adultos mais jovens 1. Embora predisposição genética e exposição a substâncias tóxicas são causas conhecidas para essa doença em cerca de um terço dos pacientes, a origem de DCM permanece amplamente claro. Num número substancial de pacientes, os auto-anticorpos contra epítopos cardíacos foram detectados e são suspeitos de desempenhar um papel crucial na iniciação e progressão da doença de 2,3. A importância dos anticorpos cardíacos é sublinhado por uma melhoria hemodinâmica observada em pacientes com CMD após a eliminação de auto-anticorpos por imunoadsorção 3-5. Uma variedade de antigénios específicos já foram identificados 2,3 e anticorpos contra estes objectivos podem ser detectados por imunoensaios. No entanto, estes ensaios não pode discriminar entre o estímulo (ou seja funcionalmente eficaz) e bloqueio de auto-anticorpos. Há cada vez mais evice que esta distinção é 6,7 crucial. Pode também considerar-se que os objectivos estabelecidos para um certo número de anticorpos cardiotrópicos ainda não identificado e, portanto, não pode ser detectada por imunoensaios. Assim, foi estabelecido um método para a detecção de anticorpos funcionalmente activos cardiotrópicos, independentemente do seu antigénio correspondente. O pano de fundo para o método é a elevada homologia normalmente observada para as regiões funcionais de proteínas cardíacas em mamíferos entre 8,9. Isto sugere que os anticorpos dirigidos contra antigénios cardíacos humanos reagem de forma cruzada com as células-alvo não-humanos, o que permite o teste de IgG de pacientes com CMD em cardiomiócitos de ratos adultos. O nosso método consiste em três passos: primeiro, a IgG é isolada a partir de plasma de paciente com Sepharose acoplada anti-IgG de anticorpos obtidas a partir de colunas de imunoadsorção (PlasmaSelect, Teterow, Alemanha). Em segundo lugar, os cardiomiócitos adultos são isolados através de perfusão com colagenase num aparelho de perfusão Langendorff usando aprotocolo modificado de trabalhos anteriores 10,11. Os cardiomiócitos obtidos estão ligados a esfregaços laminina revestidos septadas e coradas com Fura-2, um corante fluorescente de cálcio selectivo que pode ser facilmente levado para dentro da célula para observar o cálcio intracelular (Ca2 +) conteúdo 12. No último passo, o efeito de IgG do paciente sobre a redução das células e os transientes de Ca 2 + de cardiomiócitos de campo estimulado é monitorizada utilizando uma linha de cálcio comercial miócito e contractilidade sistema de monitorização (IonOptix, Milton, MA, EUA), ligado a um padrão inverso fluorescente microscópio.

Dois exemplos para a medição do inotropismo celular no campo estimulado cardiomiócitos adultos (Figura 2), utilizando um dos miócitos Ca 2 + e do sistema de gravação de contratilidade são dadas abaixo. Figura 3 dá uma impressão de uma medida de controlo, enquanto que na Figura 4, o efeito dos anticorpos cardiodepressive de um paciente com DCM é mostrado. Em ambos os exemplos, encurtamento celular inicial e Ca 2 +</s...

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Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

O método apresentado oferece um modo para detectar auto-anticorpos funcionais eficazes cardiotrópicos no plasma de pacientes com cardiomiopatia dilatada, independentemente do antigénio específico, por meio da análise do impacto da imunoglobulina paciente isolado no encurtamento celular e os transientes de cálcio intracelular em cardiomiócitos de ratos isolados.

Medição dos Efeitos de anticorpos sobre a função celular de cardiomiócitos isolados

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Medição do Ca citosólico 2 + Em Isolated linfáticos contráteis

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Imunologia e Infecção

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Métodos para a detecção quantitativa de anticorpos induzida pela ativação do complemento no Glóbulos Vermelhos

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Citometria de fluxo de partículas ligadas aos Bet v 1 alérgeno no PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Teste de tolerância à glicose intraperitoneal, medição da função pulmonar e a fixação do pulmão para estudar o impacto da obesidade e metabolismo prejudicado em resultados pulmonares

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Avaliação dos efeitos de drogas baseados em anticorpo murino da medula óssea e ativação de macrófagos peritoneais

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Um método para a medição da função da glândula salivar em ratos

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...