Name: chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry
Uploaded: 2012-08-19T14:00:00
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Wir möchten die NSF für die Finanzierung (CBET-0846259) anerkennen.

Siehe Tabelle 1 für die Herstellung von allen Medien, Puffer und Lösungen in diesem Protokoll verwiesen wird. 1. Die Produktion von Aha-markierten Adenovirus <ol><li> Planen elf 100-mm-Gewebekulturschalen von humanen embryonalen Nierenzellen (HEK 293) in HEK 293-Zelle Wachstumsmedium gehalten (siehe Tabelle 1) bei 37 ° C, bis sie 80 erreicht haben, - 90% Konfluenz gezüchtet. (Hinweis:. Kulturen mit mehr als 90% Konfluenz kann es schwierig sein zu infiz...

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	<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells.">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+"Clickable"+Amino+Acids+and+Sugars.">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors:+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability.">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li><li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation.">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li><li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover.">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+(Ad)+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors.">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li><li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation.">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Strain-Promoted+[3+++2]+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems.">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li><li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells.">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li></ol>

Die Entwicklung der chemoselektiven und bioorthogonale Click-Reaktionen, einschließlich derer von Aziden, ist eine sich schnell entwickelnde Gebiet der Forschung, und anschließend gibt es eine wachsende Zahl dieser Reaktionen aus für Biokonjugation Anwendungen wählen. Wir haben den Rahmen dieses Protokoll darauf beschränkt, nur zwei Methoden, die wegen ihrer Nützlichkeit in unserem eigenen Labor und kommerzielle Verfügbarkeit aller Reagenzien wurden so gewählt sind. In der ersten sol...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Adenovirus Typ 5 (Ad5), die ein GFP-Transgen </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> Menschliche embryonale Nieren (HEK 293-Zellen) </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbecco modifiziertes Eagle Medium (DMEM), hohe Glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, kein Methionin, Cystein nicht (DMEM-Met / Cys-), High Glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Rinderkalbserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> Penicillin - Streptomycin 100 × Solution (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0,5% Trypsin-EDTA (10 ×) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 mm Zellkulturschale, Gewebekultur-behandelte Polystyrol </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Zellkultur CO 2-Inkubator </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hämozytometer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biosicherheitswerkbank </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sterile Spritze Filter (0,2 mu m, Celluloseacetat) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Europa) </td></tr><tr><td> Avanti JE Zentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Konischen Röhrchen (50 ml, steril) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13,2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Ultrazentrifugation ausgestattet mit einem SW 41 und SW 60 Rotor </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Biopur Safe-Lock Reaktionsgefäße, 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> Centrifuge 5418 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Sep Gelfiltration Spin Columns </td><td> Princeton Separations </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Sterile Nadel 18 Gauge </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stickstoff Glovebag (wenn desoxygenierten CuAAC durchgeführt werden soll) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dewar-Gefäß </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Flüssiger Stickstoff </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektrophorese-Zelle </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzgel Scanner </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ready Gel Tris-HCl-Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetylierten N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Bathophenanthrolindisulfonsäure (BDA) Dinatriumsalz </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris-Base (Tris (hydroxymethyl) aminomethan) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dinatriumphosphat (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 M HCl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycerin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-Cystein </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-Methionin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (Natriumdodecylsulfat) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromphenolblau </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cäsiumchlorid (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Kupfer (I) bromid (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Calciumchlorid (CaCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kaliumchlorid (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid (MgCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Alkin-Sonde für CuAAC * </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA Alkin </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Gespanntes Alkin-Sonde für SPAAC * </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBO Alkin </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> * Bekannte Anbieter von Klick-Chemie Reagenzien und Kits beinhalten Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click-Chemie-Tools, und baseclick. Eine Vielzahl von Alkin Farbstoffe und Targeting-Liganden können in diesen Anbietern &#39;Katalogen.

chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry

Die Modifikation von Viruspartikeln ist eine signifikante Menge an Aufmerksamkeit für die ein enormes Potenzial für ein Aufschlagen Gentherapie, onkolytischen Anwendungen und die Entwicklung von Impfstoffen erhalten. 1,2,3 Aktuelle Ansätze zur Modifizierung viralen Oberflächen, die meist Genetik-basiert sind, oft von der Dämpfung leiden Virus-Produktion, Infektiosität und zellulären Transduktion. Mit 4,5 chemoselektive Klick-Chemie, haben wir eine einfache alternative Methode, die diese Probleme umgeht, während verbleibenden hoch flexibel und zugänglich entwickelt. 1,2 Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirksamkeit der Verwendung bioorthogonalen Click-Chemie, die Oberfläche des Adenovirus Typ 5-Teilchen zu modifizieren demonstrieren. Dieses zweistufige Verfahren kann sowohl therapeutisch 1 oder analytisch 2,6 verwendet werden, wie es für die chemoselektive Ligation von Targeting-Moleküle, Farbstoffe oder andere Moleküle von Interesse erlaubt an Proteinemit Azid-Tags voretikettiert. Die drei wichtigsten Vorteile dieser Methode sind, dass (1) metabolische Markierung wenig bis gar keine Auswirkungen auf die virale Fitness, 1,7 demonstriert (2) eine breite Palette von Effektor-Liganden können verwendet werden, und (3) Es ist bemerkenswert schnelle, zuverlässige und einfach zu erreichen. 1,2,7 Im ersten Schritt dieses Verfahrens werden Adenoviruspartikel hergestellt trägt entweder azidohomoalanine (Aha, ein Methionin Surrogat-) oder die unnatürliche Zucker O-verknüpfte N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), die beide das Azid (N-3) funktionelle Gruppe. Nach der Reinigung der azidmodifizierten Viruspartikel, wird ein Alkin Sonde, die die fluoreszierende TAMRA-Einheit in einem chemoselektive Weise wie die Vor-markierte Proteine ​​oder Glykoproteine ​​ligiert. Schließlich wird eine SDS-PAGE-Analyse durchgeführt, um die erfolgreiche Ligation von der Sonde auf der viralen Capsidproteine ​​zu demonstrieren. Aha Inkorporation wird gezeigt, dass alle Viruskapsids beschriftenProteine ​​(Hexon, Penton und Fiber), während die O-Aufnahme resultiert in GlcNAz Kennzeichnung von Fiber nur. In diesem sich entwickelnden Gebiet, haben mehrere Methoden für die Azid-Alkin-Ligation erfolgreich entwickelt, jedoch nur die beiden haben wir festgestellt, dass die bequemste haben werden hier gezeigt - Dehnungs-Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) und Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) unter Sauerstoff befreiten Atmosphäre.

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Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Adenovirus-Partikeln wurden entwickelt, um entweder die unnatürliche Aminosäure analogen azidohomoalanine oder die Azido Zucker enthalten<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. Die Azidgruppe eines jeden wird chemoselektiv über &quot;Klick&quot;-Chemie Reaktionen als mittels viraler Oberflächenmodifizierung ligiert.

Chemoselektive Modifizierung von Oberflächen durch Viral Bioorthogonale Click-Chemie

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

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Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...