Name: chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry
Uploaded: 2012-08-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry at JoVE.com

我々は、資金調達のためのNSF（CBET-0846259）を確認したいと思います。

このプロトコルで参照されるすべてのメディア、バッファーおよび溶液の調製については、 表1を参照してください。 1。 AHA-標識されたアデノウイルスの生産<ol><li>コンフルエント90％ -彼らが80に達するまで37℃でHEK 293細胞増殖培地中で維持したヒト胚腎細胞（HEK 293）（ 表1参照）の11を100mm組織培養皿を準備します。 （注：90％以上のコンフ?...

<ol>
	<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells.">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+"Clickable"+Amino+Acids+and+Sugars.">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors:+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability.">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li><li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation.">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li><li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover.">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+(Ad)+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors.">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li><li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation.">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Strain-Promoted+[3+++2]+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems.">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li><li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells.">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li></ol>

アジドのものも含めて化学選択とbioorthogonalクリック反応の開発は、研究の急速に進化している領域であり、その後、バイオコンジュゲーションアプリケーションの中から選択するこれらの反応の増加があります。我々は、我々自身の研究室とすべての試薬の商業的利用であるため、その有用性から選ばれた唯一つの方法を含めるには、このプロトコルの範囲が制限されています。 <p class="...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> GFP遺伝子を含むアデノウイルス5型（Ad5） </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td>ヒト胎児腎臓（HEK 293）細胞</td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、高グルコース</td><td>インビトロジェン</td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地、無メチオニン、システインなし（DMEM-MET /-Cys）を、高グルコース</td><td>インビトロジェン</td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td>仔ウシ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン100×ソリューション（ペン連鎖球菌） </td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0.5パーセントトリプシン-EDTA（10×） </td><td&gt;インビトロジェン</td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 mmの細胞培養皿、組織培養処理したポリスチレン</td><td> BDファルコン</td><td> 353003 </td></tr><tr><td>細胞培養CO 2インキュベーター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジフィルター（0.2μmのセルロースアセテート） </td><td> VWR </td><td> 28145-477（NA）、514から0061（ヨーロッパ） </td></tr><tr><td>アヴァンティJEの遠心</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 369001 </td></tr><tr><td>コニカルチューブ（50ミリリットル、滅菌） </td><td> BDファルコン</td><td> 352098 </td></tr><tr><td>チューブ、Thinwall、超クリア、13.2ミリリットル、14×89ミリメートル</td><td>ベックマン</td><td> 344059 </td></tr><tr><td> SW 41及びSW 60 Rを搭載した超遠心otor </td><td>ベックマン</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフBiopurセイフ - ロックチューブ、1.5ミリリットル</td><td>エッペンドルフ</td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td>遠心機5418 </td><td>エッペンドルフ</td><td> 5418 </td></tr><tr><td>遠心〜9月ゲルろ過スピンカラム</td><td>プリンストンセパレーション</td><td> CS-901 </td></tr><tr><td>滅菌した針、18ゲージ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>窒素グローブ袋（脱酸素CuAACが実行されることになっている場合） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュワーフラスコ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気泳動セル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光ゲルスキャナー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レディゲルのTris-HClゲル</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td>イエナバイオサイエンス</td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td>アセチル化N-azidoacetylgalactosamine（AC 4 GalNAz） </td><td>インビトロジェン</td><td> C33365 </td></tr><tr><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td>バソフェナントロリンジスルホン酸（BDA）ナトリウム塩</td><td> MPのバイオメディカル</td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム（ナ2 HPO 4） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水（PBS） </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1MのHCl </td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-システイン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-メチオニン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS（​​ドデシル硫酸ナトリウム） </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化セシウム（CsCl密度） </td><td></td><td> ＆n個のBSPは、 </td></tr><tr><td>銅（I）ブロマイド（CuBr） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム（CaCl 2） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム（KCl） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム（MgCl 2の ） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> CuAAC *のアルキンプローブ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRAアルキン</td><td>インビトロジェン</td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> SPAAC *の緊張したアルキンプローブ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBOアルキン</td><td>インビトロジェン</td><td> C10410 </td></tr></tbody></table>クリックケミストリー試薬およびキットの*注目すべきベンダーは、Invitrogen社、イエナバイオサイエンス、ベリー·アソシエイツ、シグマアルドリッチ、グレンリサーチ、化学ツール]をクリックし、Baseclickが含まれています。アルキン色素と標的リガンドの様々なこれらのベンダーのカタログに記載されています。

chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry

ウイルス粒子の修飾は、遺伝子治療、腫瘍溶解性アプリケーションやワクチン開発に影響を与えるために、その途方もない可能性のために注目かなりの量のを受けています。主に遺伝学ベースでウイルスの表面を、変更することに1,2,3現在のアプローチは、しばしば減衰に苦しむウイルス産生の、感染性と細胞の情報伝達。4,5化学選択クリックケミストリーを使用して、我々は、柔軟性の高いアクセスの両方を維持しながら、これらの問題を回避し簡単な代替アプローチを開発しました。1,2 このプロトコルの目的は、アデノウイルス5型粒子の表面を変更するbioorthogonalクリックケミストリーを用いての有効性を実証することである。それは、タンパク質に標的分子、染料または関心のある他の分子の化学選択的ライゲーションすることができ、この2段階のプロセスは、両方の治療1または分析的に、2,6を使用することができますアジタグで事前標識。このメソッドの3つの主要な利点は、（1）代謝標識は、ウイルスフィットネスに影響を及ぼすことなく、1,7に少し例を示していること、（2）エフェクターリガンドの広い配列を利用することができる、（3）それが著しく、高速で信頼性の高いです。アクセスしやすい。1,2,7 この手順の最初のステップでは、アデノウイルス粒子がazidohomoalanine（AHA、メチオニンサロゲート）や不自然な糖アジド（-N 3）の機能が含まれ、どちらもO-結合N-azidoacetylglucosamine（O-GlcNAz）、のいずれかをベアリング製造されグループ。アジドで修飾されたウイルス粒子の精製後、蛍光TAMRA部分を含むアルキンプローブは、あらかじめ標識したタンパク質または糖タンパク質の化学選択的な方法で連結されています。最後に、SDS-PAGE分析は、ウイルスキャプシドタンパク質上のプローブのライゲーション成功を実証するために実行されます。 AHAの取り込みは、すべてのウイルスキャプシドにラベルを付けることが示されているタンパク質（ヘキソン、ペントンおよび光ファイバ）、唯一の繊維の標識O-GlcNAz取り込み結果中。 この進化分野では、アジド - アルキンライゲーションのために複数のメソッドが正常に開発されてきた。しかし、我々は最も便利であることが判明した2つだけがここに実証されて - ひずみ昇格アジド - アルキン環（SPAAC）と銅触媒によるアジド - アルキン環（CuAAC）脱酸素雰囲気下で。

Watch this Scientific Journal Video about Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry at JoVE.com

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

アデノウイルス粒子は、非天然アミノ酸類似体azidohomoalanineまたはアジド糖のいずれかを含むように設計されています<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz。それぞれのアジド基は、化学選択的にウイルスの表面改質の手段として &quot;クリック&quot;化学反応を介して連結されています。

Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

ウイルスの変異頻度のRNAウイルスと特性の忠実性の変異の分離

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

呼吸器病原体に対する宿主細胞応答を研究するために偏ヒト気道上皮Calu-3細胞の液体に覆われた文化の確立<em&gt;インビトロ</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発<em&gt; Q熱リケッチア</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

表面上のヒトノロウイルスの検出のためのスワブサンプリング方法

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...