Name: chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry
Uploaded: 2012-08-19T14:00:00
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Nos gustaría agradecer la NSF para su financiación (CBET-0846259).

Consulte la Tabla 1 para la preparación de todos los medios de comunicación, tampones y soluciones de referencia en este protocolo. 1. La producción de Aha-Etiquetada Adenovirus <ol><li> Preparar once de 100 mm placas de cultivo de tejidos de células renales embrionarias humanas (HEK 293) se mantienen en HEK 293 medio de crecimiento celular (ver Tabla 1) a 37 ° C hasta que hayan alcanzado 80 a 90% de confluencia. (Nota:. Los cultivos con confluencia m...

<ol>
	<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells.">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+"Clickable"+Amino+Acids+and+Sugars.">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors:+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability.">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li><li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation.">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li><li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover.">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+(Ad)+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors.">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li><li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation.">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Strain-Promoted+[3+++2]+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems.">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li><li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells.">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li></ol>

El desarrollo de las reacciones y haga clic en quimioselectiva bioorthogonal, incluidos los de azidas, es una zona de rápida evolución de la investigación, y, posteriormente, hay un creciente número de estas reacciones a elegir para aplicaciones bioconjugation. Hemos limitado el alcance de este protocolo para incluir sólo dos métodos que fueron escogidos debido a su utilidad en nuestro propio laboratorio y la disponibilidad comercial de todos los reactivos. En la ruta tales primera - c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Adenovirus tipo 5 (Ad5), que contiene un transgén GFP </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> De riñón embrionario humano (HEK 293) células </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbecco Eagle modificado (DMEM), glucosa alta </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modificado de Eagle Medium, sin metionina, sin cisteína (DMEM-Met /-Cys), glucosa alta </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Becerro de suero bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> La penicilina - estreptomicina 100 × Solución (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0,5% de tripsina-EDTA (10 x) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> Celular 100 mm cultura plato, cultivo de tejidos de poliestireno tratada </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Cultivo de células incubadora de CO 2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Seguridad de la Biotecnología del gabinete </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Estéril filtro de jeringa (0,2 micras, acetato de celulosa) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Europa) </td></tr><tr><td> Avanti JE centrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Tubos cónicos (50 ml, estéril) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tubo, de paredes finas, con claridad, 13,2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga equipado con un 41 SW y SW 60 rotor </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubos, 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> Centrifugar 5418 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Sep columnas de filtración de gel de giro </td><td> Princeton separaciones </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Aguja estéril de calibre 18 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> El nitrógeno bolsa de guantes (si CuAAC desoxigenada se va a realizar) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dewar frasco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nitrógeno líquido </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La electroforesis de células </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Escáner de gel fluorescente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Preparado gel de Tris-HCl gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biociencias </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetilado N-azidoacetylgalactosamine (Hch 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Batofenantrolina disulfónico (BDA) sal disódica </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> El metanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base Tris (tris (hidroximetil) aminometano) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfato disódico (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> HCl 1M </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicerol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-metionina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (dodecilsulfato de sodio) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> El cloruro de cesio (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> De cobre (I) bromuro (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de calcio (CaCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de Potasio (KCL) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de magnesio (MgCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De cloruro de sodio (NaCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Acetilénicos sonda para CuAAC * </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA acetilénicos </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Tensa la sonda de alquino * SPAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBO acetilénicos </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> * Los vendedores destacados de reactivos de química y haga clic en kits incluyen Invitrogen, Biociencias de Jena, los asociados de Berry, Sigma-Aldrich, Investigación Glen, haga clic en Herramientas de Química, y Baseclick. Una variedad de tintes alquino y ligandos dirigidos se pueden encontrar en los catálogos de estos vendedores.

chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry

La modificación de las partículas del virus ha recibido una cantidad significativa de la atención por su enorme potencial para impactar en la terapia génica, aplicaciones y desarrollo de vacunas oncolíticos. 1,2,3 Los enfoques actuales para la modificación de las superficies virales, que son en su mayoría basado en la genética, a menudo sufren de atenuación de producción de virus, la infectividad y celulares de transducción de 4,5. Uso de la química clic quimioselectiva, hemos desarrollado un método alternativo sencillo que deja de lado estos temas sin dejar de ser altamente flexible y accesible. 1,2 El objetivo de este protocolo es demostrar la efectividad del uso de la química clic bioorthogonal para modificar la superficie de adenovirus tipo 5 partículas. Este proceso de dos pasos puede ser utilizado tanto terapéuticamente 1 o analíticamente, 2,6, ya que permite la ligadura quimioselectiva de moléculas dirigidas, colorantes u otras moléculas de interés en las proteínaspre-etiquetados con etiquetas de azida. Las tres principales ventajas de este método son que (1) marcado metabólico demuestra poco o ningún impacto en la replicación viral, 1,7 (2) una amplia gama de ligandos efectores pueden ser utilizados, y (3) es muy rápido, fiable y de fácil acceso. 1,2,7 En el primer paso de este procedimiento, se producen partículas de adenovirus teniendo cualquiera azidohomoalanine (Aha, un sustituto metionina) o el azúcar no natural O-N-ligados azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ambos de los cuales contienen la azida (-N 3) funcional grupo. Después de la purificación de las partículas del virus azida modificados, una sonda fluorescente alquino que contiene el resto TAMRA se liga de manera quimioselectiva a las proteínas pre-etiquetados o glicoproteínas. Finalmente, un análisis de SDS-PAGE se realizó para demostrar la ligadura con éxito de la sonda sobre las proteínas de la cápside viral. Incorporación de Aha se muestra a etiquetar todos cápside viralproteínas (Hexon, Penton y fibra), mientras que O-GlcNAz resultados incorporación en el etiquetado de fibra óptica sólo. En este campo en evolución, múltiples métodos para la ligadura de azida-alquino se han desarrollado con éxito, sin embargo, sólo los dos que hemos encontrado para ser más conveniente se ha demostrado en este documento - la cepa promovido azida-alquino cicloadición (SPAAC) y el cobre-catalizada cicloadición azida-alquino (CuAAC) bajo una atmósfera desoxigenada.

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Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Partículas de adenovirus se han diseñado para contener la natural azidohomoalanine análogo del ácido amino o el azúcar azida<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. El grupo azida de cada uno se quimioselectivamente ligó a través de reacciones químicas &quot;clic&quot; cuando un medio de modificación de la superficie vírica.

Modificación de superficies quimioselectiva virales a través de Química Haga clic en Bioorthogonal

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

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El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

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Investigación

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RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Preparación de ADN viral de nucleocápside

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Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

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piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

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piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

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