Name: chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry
Uploaded: 2012-08-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry at JoVE.com

Vi vill erkänna NSF för finansiering (CBET-0.846.259).

Se tabell 1 för beredning av alla media, buffertar och lösningar som refereras i detta protokoll. 1. Produktion av Aha-märkt adenovirus <ol><li> Framställ elva 100-mm vävnadsodlingsplattor av humana embryonala njurceller (HEK 293) som upprätthålls i HEK 293 celltillväxt-medium (se tabell 1) vid 37 ° C tills de har nått 80 till 90% konfluens. (Obs!. Kulturer med sammanflytande över 90% kan vara svåra att infektera och får inte producera virus s...

<ol>
	<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells.">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+"Clickable"+Amino+Acids+and+Sugars.">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors:+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability.">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li><li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation.">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li><li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover.">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+(Ad)+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors.">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li><li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation.">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Strain-Promoted+[3+++2]+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems.">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li><li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells.">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li></ol>

Utvecklingen av kemoselektiv och bioorthogonal klicka reaktioner, däribland azider, är en snabbt växande forskningsområde, och därefter finns det ett växande antal av dessa reaktioner att välja mellan för biokonjugering applikationer. Vi har begränsat omfattningen av detta protokoll till att omfatta endast två metoder som valdes på grund av deras användbarhet i vårt eget labb och kommersiell tillgänglighet av alla reagenser. I den första sträckan - stam-främjas azid-alkyn cy...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Adenovirus typ 5 (Ad5), som innehöll en GFP-transgen </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> Human embryonal njure (HEK 293)-celler </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), med hög Glukos </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbeccos modifierade Eagle-medium, utan metionin, nr Cystein (DMEM-Met /-Cys), hög glukos </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Bovint kalvserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> Penicillin - Streptomycin 100 × Solution (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0,5% trypsin-EDTA (10 x) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 mm Cell Culture Dish, vävnads-kultur behandlade polystyren </td><td> BD Falcon </td><td> 353.003 </td></tr><tr><td> Cellodling CO2 inkubator </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biosäkerhet skåp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sterilt sprutfilter (0,2 ^ m, cellulosaacetat) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Europa) </td></tr><tr><td> Avanti JE centrifug </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369.001 </td></tr><tr><td> Koniska rör (50 ml, sterilt) </td><td> BD Falcon </td><td> 352.098 </td></tr><tr><td> Tube, tunnväggiga, Ultra-Klar, 13,2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344.059 </td></tr><tr><td> Ultracentrifug utrustad med en SW 41 och SW 60 ROtor </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf Biopur Safe-Lock rör, 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> Centrifugera 5418 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Sep gelfiltrerings spinnkolonner </td><td> Princeton Separationer </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Steril nål, 18 gauge </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kväveinnehållande påse (om deoxygenerad CuAAC skall utföras) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dewar-kolv </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Flytande kväve </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektroforescell </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluorescerande gel skanner </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Klar gel Tris-HCl Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> Anaspec </td><td> 63.669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetylerades N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88.905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Batofenantrolin-disulfonsyra (BDA) dinatriumsalt </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Dimetylsulfoxid (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris-bas (tris (hydroximetyl) aminometan) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dinatriumfosfat (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 M HCl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-cystein </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-metionin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (natriumdodecylsulfat) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromfenolblått </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cesiumklorid (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Koppar (I) bromid (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kalciumklorid (CaCl2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kaliumklorid (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumklorid (MgCl2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Natriumklorid (NaCI) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Alkyn sond för CuAAC * </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA alkyn </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Ansträngt alkyn sond för SPAAC * </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBO alkyn </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> * Kända leverantörer av reagens klicka kemi och kit inkluderar Invitrogen, Jena biovetenskap, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, klicka kemi Verktyg och Baseclick. En mängd olika alkyn färgämnen och riktade ligander kan hittas i dessa leverantörers kataloger.

chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry

Ändringen av viruspartiklar har fått en betydande uppmärksamhet för sin enorma potential för att påverka genterapi, onkolytiska applikationer och utveckling av vaccin. 1,2,3 Nuvarande metoder för att modifiera virala ytor, som oftast genetik-baserade, ofta lider av dämpning av virus produktion, smittsamhet och cellulära transduktion. 4,5 Använda kemoselektiv klick kemi, har vi utvecklat en enkel alternativt tillvägagångssätt som undviker dessa frågor samtidigt som den är både mycket flexibel och tillgänglig. 1,2 Målet med detta protokoll är att visa effektiviteten av att använda bioorthogonal klicka kemi för att modifiera ytan av adenovirus typ 5 partiklar. Denna två steg kan användas både terapeutiskt 1 eller analytiskt, 2,6 eftersom det möjliggör kemoselektiv ligering av målmolekyler, färgämnen eller andra molekyler av intresse på proteinermärkt i förväg med azid taggar. De tre stora fördelarna med denna metod är att (1) metabolisk märkning visar liten eller ingen effekt på viral fitness, 1,7 (2) ett brett utbud av effek-ligander kan användas, och (3) Det är otroligt snabb, pålitlig och lätt att nå. 1,2,7 I det första steget av detta förfarande, är adenoviruspartiklar produceras som bär antingen azidohomoalanine (Aha, en metionin surrogat) eller den onaturliga socker O-kopplad N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), vilka båda innehåller aziden (-N3) funktionell grupp. Efter rening av de azid-modifierade viruspartiklar, är en alkyn-prob innehållande den fluorescerande TAMRA-delen ligerades i en kemoselektiv sätt att de pre-märkta proteiner eller glykoproteiner. Slutligen är en SDS-PAGE-analys utfördes för att demonstrera framgångsrik ligering av sonden på de virala kapsidproteinerna. Aha inkorporering visas att märka allt viruskapsidenproteiner (hexon, Penton och Fiber), medan O-GlcNAz inkorporering resulterar i märkning av Fiber bara. I detta växande område, har flera metoder för azid-alkynen ligering kunnat utvecklas, men endast de två vi har funnit vara mest lämplig demonstreras här - stam-främjas azid-alkyn cykloaddition (SPAAC) och koppar-katalyserade azid-alkyn cykloaddition (CuAAC) under syrebefriad atmosfär.

Watch this Scientific Journal Video about Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry at JoVE.com

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Adenoviruspartiklar är konstruerade för att innehålla antingen det onaturliga aminosyra azidohomoalanine-analog eller azido socker<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. Azidgruppen för vardera kemoselektivt ligeras via &quot;klicka&quot; kemi reaktioner som ett sätt att viral ytmodifiering.

Kemoselektiv Ändring av virala ytor via Bioorthogonal Klicka Kemi

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Med hjälp av en Pan-Viral microarray analys (Virochip) till skärm kliniska prover för virala patogener

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolering av Fidelity Varianter av RNA-virus och karakterisering av virus mutationsfrekvensen

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Beredning av viral DNA från Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion och Titering av rekombinanta Adeno-associerad virala vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Använda klicka kemi för att mäta effekten av virusinfektion på Host-cell RNA-syntes

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Utvecklingen av lyofiliserad Loop-medie Isothermal amplifieringsreagenserna för detektion av<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Mätning influensaneuraminidas Inhibition Antikroppstitrar genom enzymkopplad lektin analys

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Pinnurvalsmetoden för påvisande av humana Norovirus på ytor

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...