Name: use of lysotracker to detect programmed cell death in embryos and differentiating embryonic stem cells
Uploaded: 2012-10-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells Video at JoVE.com

Ringraziamo i membri del laboratorio Mariani aiuto la modifica del protocollo. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione di formazione post-dottorato CIRM (JLF), uno stage CIRM BRIDGES (TZTT), E. Robert e maggio R. Wright Foundation (FVM), e la University of Southern California (FVM).

1. Colorazione LysoTracker di embrioni di topo <ol><li> Generazione di embrioni di topo inserendo giovani (5-6 settimana fa) femmine in gabbie prigionieri di sesso maschile. Monitorare il mattino seguente per la comparsa di un tappo vaginale che indica che si è verificato l&#39;accoppiamento. Se la femmina è incinta, a mezzogiorno in quel giorno si chiama 0,5 dpc (giorni dopo il coito). La procedura qui presentata è l&#39;ideale per gli embrioni 7-13 DPC. </li><li> Il giorno embrionale di interesse, l&#39;eutanasia...

<ol>
	<li>Baehrecke, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+death+shapes+life+during+development.">How death shapes life during development.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).</li><li>Meier, P., Finch, A., Evan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+development.">Apoptosis in development.</a> Nature. 407, 796-801 (2000).</li><li>Ikonomidou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+apoptotic+neurodegeneration+and+fetal+alcohol+syndrome.">Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome.</a> Science. 287, 1056-1060 (2000).</li><li>Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+embryonic+cell+populations+to+ethanol-induced+apoptosis:+implications+for+alcohol-related+birth+defects+and+neurodevelopmental+disorder.">Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).</li><li>Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescence+of+5-FU-treated+fetal+rat+limbs+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+Lysotracker.">Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker.</a> Cytometry A. 53, 9-21 (2003).</li><li>Jacobson, M. 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Cell. 14, 277-287 (2004).</li><li>Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal+compartment+as+intracellular+calcium+store+in+MDCK+cells:+a+possible+involvement+in+InsP3-mediated+Ca2++release.">The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release.</a> Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).</li><li>Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+of+apoptosis+in+organogenesis-stage+mouse+embryos.">Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos.</a> Cytometry. 33, 348-354 (1998).</li><li>Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+morphology+in+mouse+embryos+by+confocal+laser+scanning+microscopy.">Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy.</a> Methods. 18, 473-480 (1999).</li><li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation.">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J. 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B., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+caspase+activity+by+hydrogen+peroxide:+implications+for+apoptosis.">Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis.</a> FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).</li><li>Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+engulf+and+clear+apoptotic+footplate+cells+in+macrophageless+PU.1+null+mouse+embryos.">Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos.</a> Development. 127, 5245-5252 (2000).</li><li>Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+induction+of+autophagy+by+Atg1+inhibits+cell+growth+and+induces+apoptotic+cell+death.">Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death.</a> Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracker+dyes+to+probe+mitochondrial+autophagy+(mitophagy)+in+rat+hepatocytes.">Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes.</a> Autophagy. 2, 39-46 (2006).</li><li>Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+autophagy+visualized+in+live+cells:+from+autophagosome+formation+to+fusion+with+endo/lysosomes.">The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes.</a> Autophagy. 1, 23-36 (2005).</li><li>Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+autophagy+is+related+to+programmed+cell+death+during+the+development+of+the+nervous+system.">How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes.</a> Autophagy. 4, 151-175 (2008).</li></ol>

Caratteristiche importanti della apoptosi comprendono il rilevamento di danno al DNA con il saggio TUNEL, insieme con la rilevazione dell&#39;attività della caspasi (rilevata con anticorpi monoclonali o una molecola legante come ZVAD-fmk), l&#39;osservazione di cambiamenti cellulari, e la presentazione di fosfatidilserina (PS ) sulla superficie della membrana (rilevata da annessina V vincolante). Ci sono alcuni svantaggi con ciascuno di questi saggi. Per esempio, la transferasi terminale utilizzato nel saggio TUNEL non...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td></td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> LysoTracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> # L-7528 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks BSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14025-076 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> EMD </td><td> EM-PX0055-3 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> VECTOR </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali </td><td> Cellgro </td><td> 25-025-CI </td><td></td></tr><tr><td> Sodio piruvato </td><td> Cellgro </td><td> 25-000-CI </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.02 </td><td></td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> b-mercaptoetanolo, 50 mM </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> Labtek-II Camera diapositive (8 pozzetti) </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 154534 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1% gelatina </td><td> Millipore </td><td> ES-006-B </td><td></td></tr><tr><td> PBS di Dulbecco (D-PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluzione Ricette Paraformaldeide al 4% Per 100 ml: <ol><li> Mescolare paraformaldeide 4 g, 90 ml H 2 O, e NaOH (una goccia di NaOH 2N). La paraformaldeide non andrà in soluzione fino ad aggiungere un po &#39;di NaOH per aumentare il pH. </li><li> Mescolare e riscaldare a 60 ° C finché tutta la polvere sia in soluzione (~ 10-20 min). Non surriscaldare. </li><li> Aggiungere 10 ml ~ 10x PBS per ottenere un volume finale di 100 ml. </li><li> Conservare a -20 ° C in comoda (~ ~ 10 ml o 40 ml) aliquote. </li></ol> AVVERTENZA: Paraformaldeide in forma &#39;frill&#39; (compresso piccoli pellet) è meno polverosa e può quindi essere misurata al di fuori di un cappuccio. Tuttavia si deve ancora indossare una maschera protettiva antipolvere (N95almeno) durante la movimentazione. EB Cultura Media Per 500 ml EB Media: <table border="1"><tbody><tr><td> DMEM: </td><td> 404,5 ml </td></tr><tr><td> FBS: </td><td> 75,0 ml </td></tr><tr><td> L-Glutammina: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Penicillina / Streptomicina: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Sodio piruvato: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol: </td><td> 500pl </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

use of lysotracker to detect programmed cell death in embryos and differentiating embryonic stem cells

La morte cellulare programmata (PCD) si verifica negli adulti per mantenere l&#39;omeostasi dei tessuti normali e durante lo sviluppo embrionale di modellare i tessuti e gli organi 1,2,6,7. Durante lo sviluppo, prodotti chimici tossici o alterazioni genetiche possono causare un aumento di PCD o modificare i modelli di PCD con conseguente sviluppo di anomalie e difetti di nascita 3-5. Per comprendere l&#39;eziologia di questi difetti, lo studio di embrioni può essere completata con prove in vitro che utilizzano differenziare staminali embrionali (ES) cellule. L&#39;apoptosi è un ben studiato forma di PCD che coinvolge sia intrinseca ed estrinseca segnalazione per attivare l&#39;enzima caspasi cascata. Alterazioni cellulari caratteristici sono blebbing membrana, restringimento nucleare, e la frammentazione del DNA. Altre forme di PCD non coinvolgono l&#39;attivazione delle caspasi e possono essere il risultato finale di autofagia prolungata. Indipendentemente dal percorso PCD, cellule morenti devono essere rimossi. Negli adulti, le cellule immunitarie perfOrm questa funzione, mentre in embrioni, in cui il sistema immunitario non ha ancora sviluppato, la rimozione avviene con un meccanismo alternativo. Questo meccanismo comporta cellule vicine (chiamati &quot;non professionali fagociti&quot;) assume un ruolo-fagocitica riconoscono il &#39;mangiami&#39; segnale sulla superficie della cellula morente e inghiottire lo 8-10. Dopo immersione, i detriti viene portato lisosomi per la degradazione. Quindi indipendentemente meccanismo PCD, un aumento dell&#39;attività lisosomiale può essere correlata con la morte cellulare aumentata. Per studiare PCD, un test semplice per visualizzare lisosomi nei tessuti spessi e multistrato culture differenziazione può essere utile. Colorante LysoTracker è una molecola altamente solubile piccola che è trattenuto in acidi compartimenti subcellulari come il lisosoma 11-13. Il colorante viene ripreso per diffusione e attraverso la circolazione. Dal momento che la penetrazione non è una, la visualizzazione ostacolo di CPS nei tessuti spessi e multistrato culture è possibile 12,13 </sup&gt;. Al contrario, TUNEL (Terminal deossinucleotidil transferasi dUTP etichettatura fine nick) analisi 14, è limitata a piccoli campioni, sezioni istologiche, e culture monostrato perché la procedura richiede l&#39;inserimento / permeabilità di un terminale transferasi. In contrasto con anilina blu, che si diffonde e si dissolve da solventi, LysoTracker Red ND-99 è risolvibile, luminoso, e stabile. La colorazione può essere visualizzato con un microscopio a fluorescenza o confocale in tutto-mount o sezione utilizzando un mezzo di montaggio acquoso o solvente 12,13. Qui descriviamo i protocolli che utilizzano questo colorante a guardare la CPS in condizioni normali e Sonic hedgehog embrioni di topo null. Inoltre, dimostriamo analisi di PCD in colture di cellule ES differenziare e presentare un metodo semplice di quantificazione. In sintesi, la colorazione LysoTracker può essere un ottimo complemento ad altri metodi di rilevazione PCD.

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Vi presentiamo un protocollo semplice per visualizzare le regioni di morte cellulare programmata (PCD) in embrioni di topo e di differenziazione staminali embrionali (ES) colture cellulari utilizzando un colorante chiamato LysoTracker altamente solubile.

L&#39;uso di LysoTracker per rilevare la morte cellulare programmata in embrioni e differenziazione delle cellule staminali embrionali

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

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