Name: preparation of drosophila central neurons for in situ patch clamping
Uploaded: 2012-10-15T13:00:00
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Die folgende Beschreibung ist nicht spezifisch für einen Motoneuronen. Es kann mit jedem Neuron eingesetzt werden. In diesem Beispiel verwenden wir den Flug Motoneuron 5 (MN5), die die beiden dorsalsten Fasern des dorsolongitudinal wing depressor Muskel (DLM) innerviert. Zu identifizieren und zu visualisieren MN5 verwenden wir die UAS/GAL4 System GFP in den Flug Motoneuronen (und einige andere Neuronen) auszudrücken. Ein. Dissection of Adult Drosophila Zugriff auf die Dorsal Teil de...

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	<li>Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+genomic+and+complementary+DNA+from+Shaker,+a+putative+potassium+channel+gene+from+Drosophila.">Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila.</a> Science. 237, 749-753 (1987).</li><li>Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+a+probable+potassium+channel+component+encoded+at+Shaker+locus+of+Drosophila.">Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila.</a> Science. 237, 770-775 (1987).</li><li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila.">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).</li><li>Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cav2-type+calcium+channels+encoded+by+cac+regulate+AP-independent+neurotransmitter+release+at+cholinergic+synapses+in+adult+Drosophila+brain.">Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain.</a> J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).</li><li>Baines, R. A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+development+of+central+neurons+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo.</a> J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).</li><li>Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+in+the+voltage-gated+sodium+channel+DmNav+regulates+activation,+inactivation,+and+persistent+current.">Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current.</a> J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).</li><li>Worrell, J. W., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+voltage-dependent+Ca2++currents+in+identified+Drosophila+motoneurons+in+situ.">Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ.</a> J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).</li><li>Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+differences+in+firing+properties+and+potassium+currents+in+Drosophila+larval+motoneurons.">Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons.</a> J. Neurophysiol. , (2011).</li><li>Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+identified+motor+neurons+in+the+Drosophila+third+instar+larva+central+nervous+system.">Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system.</a> J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).</li><li>Pulver, S. R., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike+integration+and+cellular+memory+in+a+rhythmic+network+from+Na+/K++pump+current+dynamics.">Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics.</a> Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).</li><li>Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nicotinic+acetylcholine+receptor+Dalpha7+is+required+for+an+escape+behavior+in+Drosophila.">The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila.</a> PLoS Biol. 4, e63 (2006).</li><li>Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite+elongation+and+dendritic+branching+are+affected+separately+by+different+forms+of+intrinsic+motoneuron+excitability.">Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability.</a> J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).</li><li>Ryglewski, S., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaker+and+Shal+mediate+transient+calcium-independent+potassium+current+in+a+Drosophila+flight+motoneuron.">Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron.</a> J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).</li><li>Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cav2+Channels+Mediate+LVA+and+HVA+Calcium+Currents+in+Drosophila+Motoneurons.">Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons.</a> J. Physiol. , (2011).</li><li>Ikeda, K., Koenig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+identification+of+the+motor+neurons+innervating+the+dorsal+longitudinal+flight+muscle+of+Drosophila+melanogaster.">Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).</li><li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Preparation+of+the+Adult+Drosophila+Ventral+Nerve+Cord+for+Giant+Fiber+Dye+Injection.">Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection.</a> J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).</li></ol>

Wenn die Visualisierung der Zellen, die mit fluoreszierenden Proteinen wie GFP, ist es wichtig, nicht zu stark freizulegen die Herstellung zu viel Licht. Dies kann im Foto führen. Wir verwenden 100W HBO Kurzbogen Quecksilberbirnen für die Beleuchtung, und nutzen wir auch neutrale Dichte (ND) von 0,8 (Chroma ND-Filter 0,3 und 0,5). Um die Qualität des Reinigungsprozesses gute Sichtbarkeit beurteilen ist entscheidend. Daher kann ND-Filter für kurze Zeiträume von etwa 20 s für mehrere Male entfernt werden. <p cla...

<table border="1"><tbody><tr><td> Agent / Artikel </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Protease Typ XIV </td><td> Sigma Aldrich USA </td><td> P5147 </td></tr><tr><td> Microfil flexiblen Injektionsnadel </td><td> World Precision Instruments USA </td><td> MF28G-5 </td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillaren, od 1,5 mm, ID 1,0 mm, kein Filament </td><td> World Precision Instruments USA </td><td> PG52151-4 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen USA </td><td> D3899 </td></tr><tr><td> Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) </td><td> <a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank">www.ellsworth.com</a> </td><td> 184 SIL ELAST KIT </td></tr><tr><td> ND-Filter-Set (unmontiert) </td><td> Chroma </td><td> 22000b Serie </td></tr><tr><td> Elektrodenhalter 1-HL-U </td><td> Momolekularen Devices </td><td> 1-HL-U </td></tr></tbody></table>

preparation of drosophila central neurons for in situ patch clamping

Short Generationszeiten und einfache genetische Techniken machen die Fruchtfliege Drosophila melanogaster eine hervorragende genetische Modell in grundlegenden neurowissenschaftlichen Forschung. Ionenkanäle sind die Grundlage aller Verhalten, da sie die neuronale Erregbarkeit zu vermitteln. Die erste Spannung Ionenkanal geklont war der Drosophila Spannung Kaliumkanal Shaker 1,2. Gegen das Verständnis der Rolle von Ionenkanälen und Membranerregbarkeit für die Funktion des Nervensystems ist es sinnvoll zu kombinieren leistungsfähige genetische Werkzeuge in Drosophila mit in situ Patch Clamp Messungen. Seit vielen Jahren solche Aufnahmen wurden von der geringen Größe der Drosophila CNS behindert worden. Darüber hinaus bildeten eine robuste Hülle aus Glia und Kollagen Hindernisse für Patch-Pipette Zugang zu zentralen Neuronen. Das Entfernen dieser Hülle ist eine notwendige Voraussetzung für Patch Clamp Messungen von jedem Neuron in der erwachsenen Drosophila CNS. In den letzten JahrenWissenschaftler konnten in situ Patch Clamp Messungen von Neuronen im erwachsenen Gehirn 3,4 und Bauchmark von embryonalen 5,6, Larven 7,8,9,10 und erwachsenen Drosophila 11,12,13,14 befragen. Eine stabile Giga-Dichtung ist die wichtigste Voraussetzung für eine gute Patch und hängt von sauberen Kontakt der Patch-Pipette mit der Zellmembran, um Kriechströme zu vermeiden. Daher muss für die gesamte Zelle in situ Patch Clamp Messungen von erwachsenen Drosophila Neuronen gründlich gereinigt werden. Im ersten Schritt hat der Ganglien-Hülle an enzymatisch behandelt und mechanisch entfernt, um die Zielzellen zu erreichen. Im zweiten Schritt hat der Zellmembran so poliert werden, dass keine Schicht aus Glia, Kollagen oder anderen Materials kann Giga-Dichtung Formation zu stören. Dieser Artikel beschreibt, wie Sie einen identifizierten zentralen Neuron in der Drosophila Bauchmark, die Flucht Motoneuron 5 (MN5 15), bereiten für somatische ganzen cell Patch Clamp Messungen. Identifizierung und Sichtbarkeit des Neurons wird durch gezielte Expression von GFP in MN5 erreicht. Wir zielen nicht auf die Patch-Clamp-Technik selbst zu erklären.

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Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping Video (Video) | JoVE

In situ Patch Clamp Messungen sind für elektrophysiologische Charakterisierung von Neuronen im intakten Schaltung verwendet. In der Drosophila genetische Modell Patch-Clamp ist schwierig, weil das ZNS ist klein und umgeben von einer robusten Hülle. Dieser Artikel beschreibt die Vorgehensweise, um die Scheide und sauber Neuronen für nachfolgende Patch Clamp Messungen entfernen.

Herstellung<em&gt; Drosophila</em&gt; Central Neuronen<em&gt; In situ</em&gt; Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

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