Name: preparation of drosophila central neurons for in situ patch clamping
Uploaded: 2012-10-15T13:00:00
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以下の説明は、1運動ニューロンに特異的ではない。これは、任意のニューロンを使用することができます。この例では、dorsolongitudinal主翼下制筋（DLM）の2 dorsalmost繊維を神経支配する運動ニューロン飛行5（MN5）を使用します。 MN5を識別し、視覚化するために、我々は飛行運動ニューロン（および他のいくつかの神経細胞）にGFPを発現するUAS/GAL4システムを使用しています。 <p class="jove_titl...

<ol>
	<li>Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+genomic+and+complementary+DNA+from+Shaker,+a+putative+potassium+channel+gene+from+Drosophila.">Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila.</a> Science. 237, 749-753 (1987).</li><li>Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+a+probable+potassium+channel+component+encoded+at+Shaker+locus+of+Drosophila.">Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila.</a> Science. 237, 770-775 (1987).</li><li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila.">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).</li><li>Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cav2-type+calcium+channels+encoded+by+cac+regulate+AP-independent+neurotransmitter+release+at+cholinergic+synapses+in+adult+Drosophila+brain.">Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain.</a> J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).</li><li>Baines, R. A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+development+of+central+neurons+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo.</a> J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).</li><li>Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+in+the+voltage-gated+sodium+channel+DmNav+regulates+activation,+inactivation,+and+persistent+current.">Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current.</a> J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).</li><li>Worrell, J. W., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+voltage-dependent+Ca2++currents+in+identified+Drosophila+motoneurons+in+situ.">Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ.</a> J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).</li><li>Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+differences+in+firing+properties+and+potassium+currents+in+Drosophila+larval+motoneurons.">Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons.</a> J. Neurophysiol. , (2011).</li><li>Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+identified+motor+neurons+in+the+Drosophila+third+instar+larva+central+nervous+system.">Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system.</a> J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).</li><li>Pulver, S. R., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike+integration+and+cellular+memory+in+a+rhythmic+network+from+Na+/K++pump+current+dynamics.">Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics.</a> Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).</li><li>Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nicotinic+acetylcholine+receptor+Dalpha7+is+required+for+an+escape+behavior+in+Drosophila.">The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila.</a> PLoS Biol. 4, e63 (2006).</li><li>Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite+elongation+and+dendritic+branching+are+affected+separately+by+different+forms+of+intrinsic+motoneuron+excitability.">Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability.</a> J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).</li><li>Ryglewski, S., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaker+and+Shal+mediate+transient+calcium-independent+potassium+current+in+a+Drosophila+flight+motoneuron.">Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron.</a> J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).</li><li>Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cav2+Channels+Mediate+LVA+and+HVA+Calcium+Currents+in+Drosophila+Motoneurons.">Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons.</a> J. Physiol. , (2011).</li><li>Ikeda, K., Koenig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+identification+of+the+motor+neurons+innervating+the+dorsal+longitudinal+flight+muscle+of+Drosophila+melanogaster.">Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).</li><li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Preparation+of+the+Adult+Drosophila+Ventral+Nerve+Cord+for+Giant+Fiber+Dye+Injection.">Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection.</a> J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).</li></ol>

GFPのような蛍光タンパク質を持つ細胞を可視化すると、それはあまりにも多くの光に準備をオーバー露出させないことが重要です。これは写真が損傷する恐れがあります。我々は、照明用100W HBOの短アーク水銀灯を使用しており、我々はまた、0.8（クロマNDフィルター0.3と0.5）の中性密度（ND）を使用しています。清掃良好な視認性の質で判断することができるようにすることはきわめて重要...

<table border="1"><tbody><tr><td> エージェント/アイテム </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>プロテアーゼXIV型</td><td>シグマアルドリッチ米国</td><td> P5147 </td></tr><tr><td> Microfil柔軟な注射針</td><td>世界の精密機器米国</td><td> MF28G-5 </td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス管、外径1.5ミリメートル、ID 1.0ミリメートル、無フィラメント</td><td>世界の精密機器米国</td><td> PG52151-4 </td></tr><tr><td> DiIを</td><td>インビトロジェン米国</td><td> D3899 </td></tr><tr><td>シルガードエラストマーキット184（ダウコーニング） </td><td> <a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank">www.ellsworth.com</a> </td><td> 184 SIL ELASTキット</td></tr><tr><td> NDフィルターセット（アンマウント） </td><td>彩度</td><td> 22000bシリーズ</td></tr><tr><td>電極ホルダー1-HL-U </td><td>モーlecularデバイス</td><td> 1-HL-U </td></tr></tbody></table>

preparation of drosophila central neurons for in situ patch clamping

短い世代時間と容易な遺伝学的手法は、 ショウジョウバエの基本的な神経科学の研究に優れた遺伝的モデルを作る。彼らは神経細胞の興奮性を媒介するので、イオンチャネルは、すべての行動の基礎となるものです。クローニングされた第一の電圧依存性イオンチャネルは、 ショウジョウバエの電位依存性カリウムチャネルシェーカー1,2だった。神経系の機能のためのイオンチャネルと膜興奮性の役割を理解することに向かって、それはその場でパッチクランプ記録内でショウジョウバエの遺伝可 ​​能な強力なツールを組み合わせることが有用である。長年にわたり、このような録音がショウジョウバエ中枢神経系の小型によって妨げられた。また、グリア細胞とコラーゲンから作ら堅牢なシースは中枢神経へのパッチピペットのアクセスのための障害を構成した。このシースの除去が成人ショウジョウバエ中枢神経系内の任意の神経細胞からパッチクランプ記録のために必要な前提条件である。近年の科学者たちは、成人の脳3,4と5,6胚、幼虫7,8,9,10、および成体ショウジョウバエ 11,12,13,14の腹側神経索のニューロンから現場パッチクランプ記録で行うことができました。安定したギガシールは良いパッチのための主要な前提条件であるとリーク電流が流れるのを回避するために、細胞膜とパッチピペットのきれいな接触に依存します。したがって、成人のショウジョウバエのニューロンから in situパッチクランプ記録で全細胞を徹底的に洗浄しなければならない。最初のステップでは、神経節シースは酵素的に処理する必要があり、機械的に標的細胞にアクセスできるようにするために削除されます。第二段階では、細胞膜は、グリア、コラーゲンまたは他の材料のない層はギガシール形成を邪魔しないことができるように研磨する必要があります。この記事では、体全体のcに対してショウジョウバエ腹神経索、飛行運動ニューロン5（MN5 15）で特定された中枢ニューロンを準備する方法について説明しますエルのパッチクランプ記録。ニューロンの同定と可視性がMN5におけるGFPの発現を標的とすることにより達成される。我々は、パッチクランプ法自体を説明することを目的としない。

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その場でパッチクランプ記録をそのまま回路内の神経細胞の電気生理学的特性評価のために使用されます。中枢神経系が小さく、堅牢な鞘に囲まれているため、ショウジョウバエ遺伝モデルパッチクランプ法では困難である。この記事では、後続のパッチクランプ記録用のシースときれいなニューロンを削除する手順について説明します。

の調製<em&gt;ショウジョウバエ</emための&gt;中央ニューロン<em&gt;その場で</em&gt;パッチクランプ

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Research

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Neuroscience

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

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