Name: substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems
Uploaded: 2012-09-08T17:00:00
Duration: 11 min 53 s
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लेखकों के लिए Jeanette रीकॉम्बीनैंट T7 आरएनए पोलीमरेज़ और चित्रा 1 तैयारी में सहायता के लिए नॉर्मन Ebelt की तैयारी के लिए Schermuly धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (FOR1680 DFG) और मैक्स प्लैंक सोसायटी से धन के द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

प्रस्तुत तरीकों कैस विभिन्न आकार पर्वतमाला के endonuclease substrates की पीढ़ी सक्षम और अनुक्रम के डिजाइन में स्वतंत्रता के साथ अलग. सिंथेटिक आरएनए oligonucleotide substrates की पीढ़ी के लिए सबसे सीधे आगे दृष्टिकोण शाही सेना कम अब आरएनए oligomers बनाने में बढ़ती लागत और तकनीकी सीमाओं के कारण डिजाइन करने के लिए सीमित है. जबकि सफल आरएनए संश्लेषण पर 100 nucleotides लंबाई के असंशोधित आरएनए oligomers के लिए सूचित किया गया है, कस्टम आरएनए संश्लेषण के लिए व्यावहारिक और किफायती अधिकतम 40 nucleotides के नीचे स्थित है. हालांकि, किसी भी अनुक्रम और संश्लेषित किया जा सकता है संशोधित nucleotides (जैसे deoxyribonucleotides) की शुरुआत करने के लिए लक्षित विस्तार में दरार साइटों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. विट्रो प्रतिलेखन में अब पूर्व CRNAs के माध्यम से उत्पन्न होना चाहिए. oligonucleotides है कि एक T7 आरएनए पोलीमरेज़ प्रमोटर शामिल की annealing मध्यवर्ती लंबाई पूर्व crRN के उत्पादन के लिए अनुमति देता हैके रूप में. नियमित रूप से और आर्थिक रूप से संश्लेषित डीएनए oligonucleotides की अधिकतम लंबाई 150 nucleotides बस के ऊपर है और इस विधि के माध्यम से सिंथेटिक पूर्व crRNAs के अधिकतम का प्रतिनिधित्व करता है. कई annealed डीएनए oligonucleotide जोड़े कि चिपचिपा समाप्त होता है एक दूसरे के साथ फार्म की विधानसभा इस अधिकतम लंबाई बढ़ाने लेकिन निर्माण के क्लोनिंग में बढ़ती चुनौतियों आवश्यक कर सकते हैं. इस विधि का मुख्य लाभ के लिए किसी भी इच्छित क्रम के साथ पूर्व crRNA constructs (और इसलिए substrates कॅस endonuclease) उत्पन्न करने की क्षमता है. यह सिंथेटिक crRNA डिजाइनों के परीक्षण की अनुमति देता है. अंत में, बड़े पूर्व crRNAs पूरे जीनोमिक CRISPR तत्वों या fractions क्या पीसीआर amplificates से प्राप्त किया जा सकता है. साइट निर्देशित mutagenesis के माध्यम से पूर्व crRNA वेरिएंट की पीढ़ी के लिए करने के लिए परिवर्तन इन विट्रो प्रतिलेखन प्लाज्मिड टेम्पलेट में पेश किया जा सकता है. इन constructs वैश्विक एक पूरे के भीतर endonucleolytic दरार पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैपूर्व crRNA विट्रो प्रतिलेखन में T7 आरएनए पोलीमरेज़ माध्यम असंशोधित शाही सेना के उत्पादन के लिए अग्रणी काम हस्तांतरण 14 RNAs और Brome मोज़ेक वायरस आरएनए 15 के आधार पर किया गया था. आम सहमति T7 आरएनए पोलीमरेज़ प्रमोटर एक मान्यता डोमेन (-17 -5 के माध्यम से) और एक आवश्यक ग्वानोसिन एक 16 प्रतिलेखन दीक्षा के साथ एक दीक्षा डोमेन (6 के माध्यम से -4) के होते हैं. एक की पोजिशन अनुप्रवाह विविध जा सकता है जो लगभग किसी भी वांछित आरएनए अनुक्रम के प्रतिलेखन के लिए अनुमति देता है. इन विट्रो रन से प्रतिलेखन टेम्पलेट्स में पैदा करने के लिए प्रस्तुत तरीकों पूरा पूर्व crRNAs है कि जीनोमिक CRISPR क्षेत्रों या सिंथेटिक पूर्व crRNA वेरिएंट मैच के इन विट्रो संश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. टेप एक triphosphate 5&#39;वर्तमान टर्मिनल के साथ उत्पन्न कर रहे हैं जब तक कि प्रतिलेखन प्रतिक्रिया जीएमपी के साथ primed है monophosphate 5 &#39;14 टर्मिनी प्राप्त. ऐसे टर्मिनी अगर टेप करने के लिए लेबल किया जाना आवश्यक हैंT4 polynucleotide kinase और γ [32] पी एटीपी. के विखंडन गतिविधि Cas6 और Cas6 तरह एंजाइमों crRNA है कि 5&#39;-हाइड्रॉक्सिल और एक 2 &#39;, 3&#39;चक्रीय फॉस्फेट टर्मिनी होते उत्पन्न. इन RNAs तो Cascade जटिल द्वारा मान्यता के लिए विश्लेषण किया जा सकता है.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियां (वैकल्पिक) </td></tr><tr><td> अंटार्कटिक फॉस्फेट </td><td> चंचु </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> इन विट्रो प्रतिलेखन ग्रेड Ultrapure Nucleotide Triphosphates </td><td> बायोसाइंस जेना </td><td> NU-1010 - परमाणु 1013 </td><td></td></tr><tr><td> तरल क्रोमैटोग्राफी, 100 ktapurifier </td><td> जीई हेल्थकेयर </td><td></td><td></td></tr><tr><td> डीएनए oligonucleotides </td><td> MWG ओपेरोन </td><td></td><td></td></tr><tr><td> आरएनए oligonucleotides </td><td> MWG ओपेरोन </td><td></td><td></td></tr><tr><td> जेल निष्कर्षण किट </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> पीसीआर शुद्धि किट </td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> स्पिन Miniprep किट </td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> प्लास्मिड मैक्सी किट </td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> चंचु </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> चंचु </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> टी -4 डीएनए ligase </td><td> चंचु </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> टी -4 polynucleotide Kinase </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 शाही सेना पोलीमरेज़ </td><td> खुद के तैयारी </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxynucleotide समाधान मिक्स </td><td> चंचु </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> मिनी बहुरूपिया टेट्रा वैद्युतकणसंचलन प्रणाली </td><td> जैव रेड </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> तूफान 840 स्कैनर </td><td&gt; जीई हेल्थकेयर </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> संग्रहण Phosphorscreen </td><td> आणविक गतिशीलता </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> मोनो क्यू 5/50 जीएल </td><td> जीई हेल्थकेयर </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion उच्च फिडेलिटी डीएनए पोलीमरेज़ </td><td> चंचु </td><td> M0530L </td><td> जीसी बफर का उपयोग </td></tr><tr><td> Toluidine ब्लू </td><td> सिग्मा </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> चंचु </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ [32 पी] एटीपी, α [32 पी] एटीपी </td><td> हार्टमैन विश्लेषणात्मक </td><td> एसआरपी-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

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Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

CRISPR / कैस बैक्टीरिया और archaea में प्रणालियों मध्यस्थता प्रतिरक्षा अनुकूली. कई कैस प्रोटीन करने के लिए लंबाई बदलती के crRNA व्यापारियों पर अभिनय endoribonucleases के रूप में कार्य करने का प्रस्ताव कर रहे हैं. यहाँ हम तीन अलग अलग दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए कैस endonuclease गतिविधि के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए पूर्व crRNA substrates उत्पन्न.

CRISPR / कैस सिस्टम Endonucleases लिए सब्सट्रेट जनरेशन

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

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