Name: substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems
Uploaded: 2012-09-08T17:00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems at JoVE.com

著者らは、図1の準備を支援するための組換え型T7 RNAポリメラーゼの準備のためのジャネットSchermulyとノーマンEbeltに感謝したいと思います。この作品は、ドイツ学術協会（DFG FOR1680）とマックス·プランク協会からの資金によって賄われていた。

1。 PCRによる長いプリcrRNA基板の世代<ol><li> CRISPRクラスタのスペーサー領域を標的とするPCRプライマーを設計。両方のプライマーにベクターへのクローニングPCR産物を用フォワードプライマーおよび制限部位（pUC19のための例えば、BamHI及びHind IIIで、 図2A）にT7 RNAポリメラーゼ（T7RNAP）プロモーター配列（5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;）を追加。 注：T7RNAPが転写の適切な開始のためのグアニジン残基を必要とします。 </li><li> PCRによりゲノムDNAから目的のプレcrRNA配列を増幅する。 </li><li>アガロースゲル電気泳動でPCR産物を分離し、ゲル所望のバンドを抽出します。粘着末端（例えば、BamHI及びHindIII、 図2（a））を作成するための制限酵素を用いてPCR産物を消化。副産物裂を除去するためにPCR精製キットを使用してPCR産物を精製する。 </li><li> 、T4 DNAリガーゼを含んでライゲーション反応を設定し、T4 DNAリガーゼ緩衝液および切断されたPCR産物とそれに対応する粘着末端で脱リン酸化線形pUCベクターを3:1のモル比。 16℃で一晩混合物をインキュベートする。標準プロトコルによって有能な大腸菌 DH5α細胞中にライゲーション混合物を変革し、成功したライゲーションを識別するために、青、白スクリーニングを使用しています。 </li><li>プラスミド調製キットを用いた白色コロニーからプラスミドを分離します。プラスミドシングによって陽性クローンを識別します。代わりに、コロニーPCRスクリーニングのために利用される可能性があります。 </li></ol> 2。 DNAオリゴヌクレオチドのアニーリングを介して中間プレcrRNA基板の世代<ol><li>前方に設計し、希望のCRISPRリピート/スペーサー配列を有するオリゴヌクレオチドを​​逆にしてください。オリゴヌクレオチドは、T7 RNAPプロモーターの配列と同様に、端末の制限部位を（pUC19のための例えば、BamHI及びHind IIIで）が含まれています。アニール後のその粘着末端フォームを確保するために、オリゴヌクレオチドを終了する（ 図2（b）参照</sチョン·&gt;）。 </li><li> T4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）を5μl、T4 PNK 10×緩衝液2μl、2μlのATPを（10mM）を含む別々の20μlの反応中の各オリゴヌクレオチドの5&#39;-リン酸化1nmolの。 37℃で1時間のために、各試料をインキュベート℃に</li><li> 2リン酸化オリゴヌクレオチドを​​ハイブリダイズする。リン酸化オリゴフォワード混合物（2.2〜）、リン酸化オリゴ逆混合物（2.2〜）、10μlの反応でT4 DNAリガーゼ10×緩衝液1μl1μlの1μlを兼ね備えています。 95℃で5分間、サンプルをインキュベートする加熱ブロック上または熱湯でのC、熱源をオフにして、混合物を室温（約2-3時間）まで冷却させます。 注：この重要なステップでは、ゆっくりとした冷却プロセスはそれぞれ単一のオリゴヌクレオチド内の構造体の形成に比べて2オリゴヌクレオチドのアニーリングに有利に働く。 </li><li>消化し、脱リン酸化したpUCベクター（0.1μgの/1μlの、ハイブリダイゼーション混合物を4μlを連結20μlのライゲーション混合物中のT4 DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液および10mMのATPを含む）添加します。 16℃で一晩静置して下さい。 </li><li>標準プロトコルによって有能な大腸菌 DH5α細胞中に連結したプラスミドを変革し、青白スクリーニングを利用しています。プラスミドを分離し、消化（所望の大きさのインサートをスクリーニングするために）とそれに続くプラスミドシングによって陽性クローンを識別します。 </li></ol> 3。カスタムRNAオリゴヌクレオチドの合成を介してショートCasのRNA基質の生成デザインショートCasのRNA基質（例えば、単一反復配列、 図2C）とカスタムRNAオリゴヌクレオチド合成の施設を利用しています。 注：RNAオリゴヌクレオチドの指定された位置（ 図2C）におけるデオキシリボヌクレオチドの封入は、RNA切断の部位を特定するために使用することができます。 4 インビトロ T7 RNAポリメラーゼ転写<ol><li> maxiprepプラスミド精製キットを使用して設計された構築物（1.9または2.7から。）を有するプラスミドを分離します。 </li><li>クローン化断片（例えば、HindIIIで）の下流を切断する制限酵素でプラスミドを線形化します。完全な消化を確認してください。 注：RNA転写物の発散定義された3 &#39;末端が望まれる場合には、設計された構造物は、上流のHindIII配列の&quot;流出&quot;は、転写用の追加特定の制限部位を含んでいる必要があります。 </li><li>クロロホルム（1:1）で抽出し、エタノール沈殿、フェノールによって線状化プラスミドを精製する。 DEPC処理滅菌水にペレットを再懸濁することにより核酸を回収する。 </li><li> 体外 T7 RNAP で 40mMのHEPES / KOH（pH 8）を、22 mMのMgCl 2、5mMジチオスレイトール、1mMのスペルミジン、各ヌクレオシド三リン酸の4mMの（ATP、CTP、GTP、UTPを含む転写混合物をオフに実行する設定）、消化の40から100μg/ mlのDEPC処理水でプラスミドおよび0.1 mg / mlのT7 RNAP。 37℃で3時間インキュベート℃、 </li><li> 8 M尿素を変性12％ポリアクリルアミドゲル（ 図3A）で得られたRNA転写物を分析します。 RNA転写物はモノQ陰イオン交換クロマトグラフィー13を介して精製し、DEPC処理滅菌水でRNA画分とペレットの再懸濁のエタノール沈殿により回収することができる。将来の使用のために、-80℃でRNAを℃で保存</li></ol> 5。 Cas6ヌクレアーゼアッセイ<ol><li>セットアップする 体外 T7 RNAP で 20μlの2 mMのATP量の減少が含まれており、2.5μlで補完された転写物（4.4参照）は、α-[32 Pは]-ATPを（10 mCiの/ mlであり、5000 Ci / mmol）はオフを実行します。変性8M尿素12％ポリアクリルアミドゲルからのゲル抽出を経由して反応生成物を精製する。オートラジオグラフィーによりバンドを可視化。 </li><li>所望の組換えCasのタンパク質を生産し、精製する。この例では、Cクロストリジウム·サーモセラムからAS6は熱降水量とNi-NTAクロマトグラフィーにより精製した。 </li><li>ヌクレアーゼアッセイ反応（ クロストリジウム·サーモセラム Cas6用などを設定し、反応混合物は、20mMのHepes（KOH PH8）、250のKCl、2mMのMgCl 2、1mMのDTT、12,000 cpmのRNA基質および1μMの酵素が含まれており、インキュベートした37℃で30分間）。 </li><li> 8 M尿素、12％ポリアクリルアミドゲル上で反応混合物（+ 10μlのRNAは、95％ホルムアミドを含むバッファをローディング）5μlをロードします。オートラジオグラフィーにより電気泳動後の切断産物を可視化します。 </li></ol> 6。代表的な結果 Casのエンドヌクレアーゼ活性を分析するためのRNA基質の例は、図3Aに示されている。 in vitro転写反応における分析100μlの5μlのアリコートをロードしました。 RNA産生の効率が異なる構築物との間で変化することに注意してください。いくつかの要因トン帽子は、得られたRNAの量に影響することが観察され、転写開始に必要な1 g次の（i）の初期シーケンスであり、（ⅱ）RNA構造の転写中に形成や世代のための制限部位の（iii）の選択肢の可能性ランオフ開裂位置の。 RNAエンドヌクレアーゼ活性の調査は、高度に精製された組換えCasのタンパク質（ 図3B）および適切なネガティブコントロールの両方が必要です。理想的には、この陰性対照試料は、調査Casのエンドヌクレアーゼ反応からできるだけ少し異なります。これは、CAS式（と同一の精製手順に従う）を使用せずに、反応緩衝液および細胞ライセートを用いたRNAのインキュベーションすることによって達成することができる。理想的なネガティブコントロールは、提案された切断部位リボの追加です。図3Cに、5 &#39;末端標識した反復配列の切断は、 クロストリジウム·サーモセラム Cas6ために示されています。下<html>同一の条件、このリピートはデオキシリボヌクレオチドが位置-9に導入されるもう基板ではありません。また、このメソッドは、切断部位に関する情報を提供します。最後に、長い間、内部でラベルされたプレcrRNAはCas6によって切断され、2つの切断断片が観察される。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> 図1 CRISPR / Casの活動の概略概観。概要では、カスケード·コンプレックスとの干渉にcrRNAsの取り込み、Cas6ヌクレアーゼによってCRISPRクラスタ（適応）、小crRNAsにCRISPR配列の転写および処理へのウイルスのDNA配列（protospacer）の挿入を次crRNAとprotospacer間の相補性に基づいてウイルス攻撃を繰り返した。 Protospacer隣接モチーフ（PAM）のマークウイルスprotospacerシーケンス。 igure 2 &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; 図2 Casのタンパク質に対するRNA基質の生成。スキームは、事前crRNA生産のために（）長いプリcrRNA基板、（B）の中間プレcrRNA基板と、（C）短いカスRNA基質を生成するためのワークフローを示しています。例の配列はクロストリジウム·サーモセラムのCRISPR配列のために提示されます。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> 図3 Cas6ヌクレアーゼアッセイ。カスタム設計されたRNAオリゴヌクレオチド（250 pmol）のおよび in vitro RNA転写物の 2つの （典型的な100μlの反応液5μl）のA.）のトルイジンブルー染色ポリアクリルアミドゲル。 B.）熱後のクロストリジウム·サーモセラムからCas6準備（80ピコモル）のSDS-PAGEゲル50℃降水℃で1時間としたNi-NTAクロマトグラフィー。 in vitro転写産物の 5 &#39;末端標識した反復配列とプレcrRNAためのエンドヌクレアーゼ活性のCas6℃）検出。位置-9におけるdNTPの導入が短いCasのRNA基質（S、 図2C）のCas6切断を廃止しました。 5 &#39;末端8 NTタグは、長いプリcrRNA基質（L、 図2（a））からcrRNAの成熟のために生成されます。バンドが変性8M尿素12％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。

<ol>
	<li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li><li>Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+RNA-interference-based+immune+system+in+prokaryotes:+computational+analysis+of+the+predicted+enzymatic+machinery,+functional+analogies+with+eukaryotic+RNAi,+and+hypothetical+mechanisms+of+action.">A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action.</a> Biol. Direct. 1, 7 (2006).</li><li>Lillest&#248;l, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+viral+defence+mechanism+in+archaeal+cells.">A putative viral defence mechanism in archaeal cells.</a> Archaea. 2, 59-72 (2006).</li><li>Makarova, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).</li><li>Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li><li>Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+and+cleavage+of+CRISPR+RNA+by+Cas6.">Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6.</a> RNA. 16, 2181-2188 (2010).</li><li>Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-+and+structure-specific+RNA+processing+by+a+CRISPR+endonuclease.">Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.</a> Science. 329, 1355-1358 (2010).</li><li>Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+maturation+of+effector+RNAs+in+a+CRISPR+interference+pathway.">Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).</li><li>Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas6+is+an+endoribonuclease+that+generates+guide+RNAs+for+invader+defense+in+prokaryotes.">Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes.</a> Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).</li><li>Wiedenheft, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+RNA-guided+surveillance+complex+from+a+bacterial+immune+system.">Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system.</a> Nature. 477, 486-489 (2011).</li><li>Garneau, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468, 67-71 (2010).</li><li>Sinkunas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas3+is+a+single-stranded+DNA+nuclease+and+ATP-dependent+helicase+in+the+CRISPR/Cas+immune+system.">Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system.</a> EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).</li><li>Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono+Q+chromatography+permits+recycling+of+DNA+template+and+purification+of+RNA+transcripts+after+T7+RNA+polymerase+reaction.">Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction.</a> Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).</li><li>Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+physical+characterization+of+an+unmodified+yeast+phenylalanine+transfer+RNA+transcribed+in+vitro.">Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).</li><li>Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+viral+RNAs+synthesized+in+vitro+show+altered+aminoacylation+and+replicase+template+activities.">Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities.</a> Nature. 311, 171-175 (1984).</li><li>McGinness, K. E., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+ribonucleotides+in+the+T7+RNA+polymerase+promoter+element.">Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element.</a> J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

提示方法は異なったサイズの範囲のCASエンドヌクレアーゼの基質の生成を有効にして、配列設計の自由度を変化させて。合成RNAオリゴヌクレオチド基質を生成するための最も簡単なアプローチは、より長いRNAオリゴマーを作成する際のコスト上昇と技術的な制限があるため、短いRNAのデザインに限定されています。成功したRNA合成は、100以上のヌクレオチド長の未修飾RNAオリゴマーのために報告されてきたが、カスタムRNA合成のための実用的かつ経済的な最大値は以下の40個のヌクレオチドに位置しています。しかし、任意の所与の配列を合成することができると修飾ヌクレオチドの標的導入（例えばデオキシリボヌクレオチド）が詳細に切断部位を分析するために利用することができます。長いプレcRNAsはin vitro転写を介して生成されるべきである。 T7 RNAポリメラーゼプロモーターを含むオリゴヌクレオチドのアニーリングは中間の長さプリcrRNの製造を可能にとして。日常的にかつ経済的に合成されたDNAオリゴヌクレオチドの最大の長さはちょうど150ヌクレオチド以上であり、この方法で合成プリcrRNAsの最大値を表します。お互いに粘着末端を形成するいくつかのアニールしたDNAオリゴヌクレオチドのペアのアセンブリは、この最大の長さを延長するが、構築物のクローニングの増加の課題を必要とすることができます。この方法の主な利点は、任意の順序で事前crRNAコンストラクト（したがって、エンドヌクレアーゼCasの基質）を生成する機能です。これは合成crRNA設計のテストを可能にします。 最後に、大規模プレcrRNAsは、その全ゲノムCRISPR要素またはその画分のPCR増幅物から得ることができます。プラスミドのin vitro転写鋳型内への変化はプリcrRNAバリアントの生成のための部位特異的変異誘発を介して導入することができます。これらの構築物は、全体の中にグローバルなエンドヌクレアーゼ切断パターンを分析するために使用することができますプリcrRNA。 in vitro転写 T7 RNAポリメラーゼを介した修正されていないRNAの生産のための先駆的な仕事は、トランスファーRNA 14およびブロムモザイクウイルスRNAの15に基づくものであった。コンセンサスT7 RNAポリメラーゼプロモーターが認識ドメイン（-5を通して-17）、必須グアノシン1 16で転写開始とともに開始ドメイン（6を通じて、-4）で構成されています。 1の位置より下流は、ほぼ任意のRNA配列の転写を可能にする変更することができる。 体外ランオフ転写テンプレートで生成するための提示方法は、ゲノムCRISPR領域または合成予備crRNAバリアントを一致完全プレcrRNAsのin vitro合成を可能にします。転写反応は、5 &#39;一リン酸末端14を得るために、GMPにプライミングされていない限り、転写物は5&#39;-末端三リン酸の存在で生成されます。転写物が標識されるなら、そのような末端が必要であるT4ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ-[32 P]-ATP。 Cas6とCas6様酵素の切断活性、5&#39;-水酸基と2 &#39;、3&#39;-環状リン酸末端を含むcrRNAを生成します。これらのRNAは、その後、カスケード複合体によって認識について分析することができる。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>南極ホスファターゼ</td><td> NEB </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> in vitro転写グレード純ヌクレオチド三リン酸で </td><td>イエナバイオサイエンス</td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td>液体クロマトグラフィー、ktapurifier 100 </td><td> GEヘルスケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td> DNAオリゴヌクレオチド</td><td> MWGオペロン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> RNAオリゴヌクレオチド</td><td> MWGオペロン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR精製キット</td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Spin Miniprepキット</td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td>プラスミドマキシキット</td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHIで</td><td> NEB </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIIIで</td><td> NEB </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ</td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> T4ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>アンビオン</td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNAポリメラーゼ</td><td>独自の準備</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デオキシソリューションミックス</td><td> NEB </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアンテトラ電気泳動システム</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td>ストーム840スキャナ</td><td&gt; GEヘルスケア</td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td>ストレージPho​​sphorscreen </td><td>分子動力学</td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td>モノQ 50分の5 GL </td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion高忠実度DNAポリメラーゼ</td><td> NEB </td><td> M0530L </td><td> GCのバッファを使用</td></tr><tr><td>トルイジンブルー</td><td>シグマ</td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19を</td><td> NEB </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32 P]-ATPは、α-[32 P]-ATP </td><td>ハルトマンアナリ</td><td> SRP-401は、SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems

ウイルスとその原核生物宿主の相互作用は、細菌と古細菌の生命の進化を形作った。原核生物は制限修飾、不稔感染とCRISPR / CASシステムを含むウイルスの攻撃を回避するためにいくつかの戦略を開発しました。 cは私がSホルト電話 alindromic R EPEAT（CRISPR）配列とsociated（CAS）遺伝子としてC RISPR数（図1）1-3 nterspaced egularly rを光沢のある、多くの細菌と最も古細菌で見つかったこれらの適応性がある免疫システムが構成されています。 Casの蛋白質とリピートの異なるセットがCRISPR / CASシステム4の少なくとも3つの主要な発散型を定義します。ユニバーサルタンパク質CAS1とCAS2は、ウイルスDNAの取り込みに関与することが提案されていること延長CRISPRクラスタ5の5 &#39;末端に2を繰り返す間に新しいスペーサ要素が生成されます。クラスタ全体をすべてのスペーサと反復配列を含む前駆-crRNAに転写され、その後も小さいcrRNAs 6月8日に多様なCas6ファミリーの酵素によって処理されます。これらcrRNAsは、5 &#39;末端（8ヌクレオチド）および3&#39;反復配列9由来末端タグに挟まれたスペーサー配列で構成されています。新しいcrRNAはウイルスDNAにCASタンパク質複合体（カスケード）監督と塩基相補10を介して、そういうものとしてそれを識別されるように、ウイルスの反復性感染症は現在、ブロックすることができます。最後に、CRISPR / Casの1型システムでは、ヌクレアーゼCAS3は、検出された侵入者のDNA 11,12を破壊してしまいます。 これらのプロセスは、原核生物の適応免疫系としてCRISPR / CASを定義し、関係Casのタンパク質の研究のために魅力的な研究分野を開いた。多くのCAタンパク質の機能は依然としてとらえどころあり、CRISPR / CASシステムの見かけの多様性の原因は照らされていない。ほとんどのCAタンパク質の潜在的な活動は、詳細なコンピュータ分析を介して予測した。 Casのタンパク質の主要な部分は、どちらのエンドヌクレアーゼ4として機能することが示されたり提案されている。 ここでは、CASエンドリボヌクレアーゼの研究のためcrRNAsと前駆-cRNAsを生成するための方法を提示します。異なるエンドヌクレアーゼアッセイは、直接RNAオリゴヌクレオチドまたはランオフ転写体外 T7 RNAポリメラーゼにおける介して生成されなくなりましcrRNAとプリcrRNA配列として合成することができる、短い反復配列を必要とします。この方法論は、内部的に標識された酵素の基質の生成と合成または変異crRNAsの作成のための放射性ヌクレオチドの取り込みを可能にします。 Cas6エンドヌクレアーゼ活性は、5&#39;-hydrとcrRNAsに事前にcrRNAsを成熟するために利用されるオキシル及び2 &#39;、3&#39;-環状リン酸末端。

Watch this Scientific Journal Video about Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems at JoVE.com

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

CRISPR / CASシステムは、バクテリアや古細菌の適応免疫を媒介する。多くのCAタンパク質は様々な長さのcrRNA前駆体に作用するエンドリボヌクレアーゼとして機能するように提案されている。ここでは、CASのエンドヌクレアーゼ活性の生化学的解析のための事前crRNA基質を生成するために3つの異なるアプローチを示しています。

CRISPR / CASシステムの酵素のための基質の生成

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

substrate-generation-for-endonucleases-of-crisprcas-systems

Research

JoVE Journal

Biology

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

診断ツールを開発するマイクロエレクト​​ロメカニカルシステム（MEMS）の使用

生物学

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of cells (approximately 25 in C. borealis) which are well characterized. The cells in the STG exhibit a broad range of outputs and are responsible for the motor actions of the stomach. The stomach contains the gastric mill which breaks down food with three internal teeth, and the pylorus which filters the food before it reaches the midgut. The STG produces two rhythmic outputs to control the gastric mill and pylorus known as central pattern generators (CPGs). Each cell in the STG can participate in one or both of these rhythms. These CPGs allow for the study of neuromodulation, homeostasis, cellular and network variability, network development, and network recovery.
The dissection of the stomatogastric nervous system (STNS) from the Jonah crab (Cancer borealis) is done in two parts; the gross and fine dissection. In the gross dissection the entire stomach is dissected from the crab. During the fine dissection the STNS is extracted from the stomach using a dissection microscope and micro-dissection tools (see figure 1). The STNS includes the STG, the oesophageal ganglion (OG), and the commissural ganglia (CoG) as well as the nerves that innervate the stomach muscles. Here, we show how to perform a complete dissection of the STNS in preparation for an electrophysiology experiment where the cells in the STG would be recorded from intracellularly and the peripheral nerves would be used for extracellular recordings. The proper technique for finding the desired nerves is shown as well as our technique of desheathing the ganglion to reveal the somata and neuropil.

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric nervous system (STNS) of the Jonah crab (C. borealis) can be used for electrophysiology, immunohistochemistry, and cell culture studies. The STNS extraction is done in two parts: the gross and fine dissection.

癌ボレアリス口胃神経系の解剖

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

ロブスターの胃の肉眼解剖、ロブスター属Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

ヒトCD40活性化B細胞の生成

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

生体系における酸素イメージング用燐光ナノプローブの合成とキャリブレーション

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

相間細胞核の力学特性を探査する生物物理学的なアッセイ：基板の歪みのアプリケーションおよびマイクロニードル操作

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

微生物システム生物学のケモスタットの使用

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

エピジェネティックリプログラミングによるヒトES細胞からMyospheresの生成

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...