Name: substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems
Uploaded: 2012-09-08T17:00:00
Duration: 11 min 53 s
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Os autores gostariam de agradecer Jeanette Schermuly para a preparação de recombinante RNA polimerase T7 e Ebelt Norman para a assistência na preparação Figura 1. Este trabalho foi financiado por fundos do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) e da Sociedade Max Planck.

1. Geração de tempo pré-crRNA substratos via PCR <ol><li> Iniciadores de PCR projeto de segmentação das regiões espaçadoras de um cluster CRISPR. Adicionar a polimerase de ARN T7 (T7RNAP) sequência promotora (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) para o iniciador directo e sítios de restrição para a clonagem do produto de PCR em um vetor de ambos os iniciadores (por exemplo, BamHI e HindIII para pUC19, fig. 2A) . Nota: O T7RNAP requer um resíduo de guanidina para a iniciação da transcrição adequada. </li><li> Amplificar a seqüência de pré-crRNA de interesse do DNA genômico por PCR. </li><li> Separar os produtos de PCR por electroforese em gel de agarose e gel de extrair a banda desejada. Digerir o produto de PCR com as enzimas de restrição para criar extremidades coesivas (por exemplo, BamHI e HindIII, fig. 2A). Purifica-se o produto de PCR com um kit de purificação de PCR para eliminar a clivagem subprodutos. </li><li> Defina-se uma reacção de ligação que contém ADN-ligase de T4, tampão de ligase T4 DNA euma relação molar de 3:1 do produto de PCR clivado e o vector linear desfosforilada pUC com as correspondentes extremidades coesivas. Incubar a mistura a 16 ° C durante a noite. Transformar a mistura de ligação em células competentes de Escherichia coli DH5a por protocolos padrão e utilizar rastreio azul branco para identificar a ligação bem sucedida. </li><li> Isolar os plasmídeos de colónias brancas, utilizando um kit de preparação de plasmídeo. Identificar os clones positivos por sequenciação de plasmídeo. Alternativamente, colónia PCR pode ser utilizado para o rastreio. </li></ol> 2. Geração de intermediário pré-crRNA substratos através de emparelhamento de oligonucleótidos de DNA <ol><li> Projetar para a frente e para trás oligonucleotídeos com o desejado CRISPR sequência de repetição / espaçador. Os oligonucleótidos contêm a sequência de um promotor T7 RNAP assim como sítios de restrição terminais (por exemplo, BamHI e HindIII para pUC19). Encerrar os oligonucleótidos de forma a assegurar que as extremidades pegajosas após recozimento (ver fig. 2B </strong&gt;). </li><li> 5&#39;-fosforilam nmol 1 de cada oligonucleótido numa reacção separada 20 uL contendo 5 uL de quinase de polinucleótidos de T4 (PNK), 2 uL de tampão PNK 10x T4, 2 ul de ATP (10 mM). Incubar cada amostra durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Hibridizar os dois oligonucleótidos fosforilados. Combinar 1 ul da mistura de oligo fosforilado para a frente (a partir de 2.2.), 1 ul da mistura inverso fosforilado oligo (a partir de 2.2.), 1 ul de tampão de T4 ADN ligase 10x numa reacção de 10 jil. Incubar as amostras durante 5 min a 95 ° C num bloco de aquecimento ou em água a ferver, desligar a fonte de calor e deixar a mistura arrefecer até à temperatura ambiente (~ 2-3 horas). Nota: Neste passo crítico, o processo de arrefecimento lento favorece a hibridação dos dois oligonucleótidos em comparação com a formação de estruturas dentro de cada um único oligonucleótido. </li><li> Ligadura 4 ul da mistura de hibridação, 1 ul de digerido e desfosforilado vector pUC (0,1 ug /ul) com ligase de ADN de T4, tampão de ligase T4 de ADN 10x e 10 mM de ATP em uma mistura de ligação 20 ul. Incubar a amostra a 16 ° C durante a noite. </li><li> Transforme os plasmídeos ligados em células de Escherichia coli competentes DH5ct por protocolos padrão e utilizar triagem branco azul. Isolar os plasmídeos e identificar os clones positivos por digestão (para a tela para inserções com o tamanho desejado) e sequenciação de plasmídeo subsequentes. </li></ol> 3. Geração de curto Cas substratos RNA via síntese de oligonucleótidos RNA personalizado Projeto de curto Cas RNA substratos (por exemplo, seqüências de repetição simples, fig. 2C) e utilizar personalizados RNA instalações de síntese de oligonucleotídeos. Nota: A inclusão de um desoxirribonucleótido a uma posição definida de um oligonucleótido de ARN (Fig. 2C), pode ser utilizado para identificar o local de clivagem de ARN. 4. In vitro T7 transcrição de ARN-polimerase <ol><li> Isolar os plasmídeos com o constructo concebido (a partir de 1.9. Ou 2.7.) Utilizando um kit de purificação de maxiprep de plasmídeo. </li><li> Linearizar o plasmídeo com a enzima de restrição que cliva a jusante do fragmento clonado (por exemplo, Hind III). Assegurar uma digestão completa. Nota: Se um 3 divergente definido &#39;terminus do transcrito de RNA é desejada, o constructo concebido deve conter um sítio de restrição adicional específico para &quot;run-off&quot; da transcrição a montante da sequência HindIII. </li><li> Purifica-se o plasmídeo linearizado por fenol: clorofórmio (1:1) e precipitação com etanol. Recuperar os ácidos nucleicos por ressuspensão do sedimento em água tratada com DEPC estéril. </li><li> Configurar uma in vitro T7 RNAP correr mistura de transcrição que contém 40 mM de Hepes / KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1 mM de espermidina, 4 mM de cada nucleósido-trifosfato (ATP, CTP, GTP, UTP ), 40-100 ug / ml de digeridoplasmídeo e 0,1 mg / ml de T7 RNAP em água tratada com DEPC. Incubar 3 horas a 37 ° C. </li><li> Analisar as transcrições de RNA obtidos sobre um gel de poliacrilamida desnaturante ureia 8 M 12% (Fig. 3A). Os transcritos de RNA pode ser purificado através de aniões Mono Q cromatografia de troca 13 e recuperado por precipitação com etanol das fracções de RNA e de ressuspensão do sedimento em água tratada com DEPC estéril. No futuro, a armazenar o RNA a -80 ° C. </li></ol> 5. Cas6 ensaio endonuclease <ol><li> Configurar uma 20 pi in vitro T7 RNAP correr mistura de transcrição (ver 4.4), que contém uma quantidade reduzida de 2 mM ATP e é complementado com 2,5 ul α-[32 P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Purifica-se os produtos da reacção por meio de extracção a partir de um gel desnaturante de ureia 8 M em gel de poliacrilamida a 12%. Visualizar as bandas por autorradiograf ia. </li><li> Produzir e purificar as proteínas recombinantes desejados Cas. Neste exemplo, CAS6 de Clostridium thermocellum foi purificado por meio de calor de precipitação e cromatografia de Ni-NTA. </li><li> Defina-se uma reacção de digestão com endonucleases (por exemplo, para Clostridium thermocellum Cas6, a mistura reaccional contém 20 mM de Hepes (KOH pH 8), 250 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 1 mM DTT, 12000 cpm de substrato de ARN e 1 uM de enzima e incubou-se a 37 ° C durante 30 min). </li><li> Carregar 5 uL da mistura de reacção (+ 10 ul de tampão de carregamento de RNA contendo 95% de formamida) em ureia 8 M em gel de poliacrilamida a 12%. Visualizar os produtos de clivagem, após eletroforese através de autorradiografia. </li></ol> 6. Resultados representativos Um exemplo de substratos de RNA para análise de actividade de endonuclease Cas é mostrado na Figura 3A. Uma parte alíquota de 5 ul de uma pi 100 analítico in vitro da reacção de transcrição foram carregados. Por favor note que a eficiência da produção de RNA varia entre diferentes construções. Alguns fatores tchapéu foram observados para influenciar a quantidade de RNA obtidos são (i) a sequência que se segue imediatamente a G 1 necessária para a iniciação da transcrição, (ii) a possibilidade de formação de estruturas de RNA durante a transcrição e (iii) a escolha do local de restrição para a geração da posição de clivagem segundo turno. A investigação da actividade de endonuclease RNA requer tanto recombinante altamente purificada Cas proteínas (Fig. 3B) e controlos negativos apropriados. Idealmente, esta amostra de controlo negativo difere tão pouco quanto possível a partir da reacção investigada endonuclease Cas. Isto pode ser alcançado através da incubação do RNA com o tampão de reacção e lisado de células sem expressão Cas (e seguindo o procedimento de purificação idêntico). Um controle negativo ideal é a adição de um desoxirribonucleótido no local de clivagem proposto. Na Figura 3C, a clivagem de uma sequência de repetição 5 &#39;terminal marcado é mostrado por Clostridium thermocellum Cas6. Em<html> condições idênticas, esta repetição não é um substrato mais quando é introduzido um desoxirribonucleótido na posição -9. Este método também fornece informações sobre o local de clivagem. Finalmente, um longo internamente marcada pré-crRNA é clivada por Cas6 e dois fragmentos de clivagem são observados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> Figura 1. Visão esquemática CRISPR / Cas atividade. A síntese segue a inserção de uma sequência de ADN viral (protospacer) para o cluster CRISPR (de adaptação), a transcrição e processamento da matriz CRISPR em crRNAs pequenas por uma endonuclease Cas6, a absorção de crRNAs no complexo da cascata e a interferência de um repetido ataque viral, baseada na complementaridade entre crRNA e protospacer. Motivos Protospacer adjacentes (PAM) seqüências protospacer marca virais. igura 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Geração de RNA substratos para Cas proteínas. O esquema mostra o fluxo de trabalho para a geração de (A) de comprimento pré-crRNA substratos, (B) intermédia pré-crRNA substratos e (C) de curto Cas RNA substratos para a produção de pré-crRNA. Seqüências de exemplo são apresentados para a matriz CRISPR de Clostridium thermocellum. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> Figura 3. Cas6 a digestão com endonucleases. A.) em gel de poliacrilamida de toluidina azul manchado de um oligonucleótido de ARN de design personalizado (250 pmol) e dois transcritos de RNA in vitro (5 ul de uma reacção de 100 uL típico). B.) SDS-PAGE em gel de uma preparação Cas6 (80 pmol) de Clostridium thermocellum depois calorprecipitação a 50 ° C durante 1 hora e cromatografia de Ni-NTA. C.) A detecção da actividade Cas6 endonucleolítica para 5 &#39;terminal de sequências de repetição rotulados e pré-crRNA transcritos in vitro. A introdução de um dNTP na posição -9 abole Cas6 clivagem do substrato por um curto RNA Cas (S, fig. 2C). A 5 &#39;terminal 8 tag nt é também gerada para crRNA maturação de longa pré-crRNA substratos (L, fig. 2A). As bandas foram separados num 8 M ureia em gel de poliacrilamida desnaturante a 12% e visualizados por autorradiografia.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Os métodos apresentados permitem a geração de substratos Cas endonucleases de gamas de tamanhos diferentes e com diferentes liberdade no desenho sequência. A abordagem mais simples e direta para a geração de substratos de oligonucleótidos sintéticos de ARN está limitada a designs de ARN curtos devido ao aumento dos custos e as limitações técnicas na criação de oligómeros mais longos de RNA. Enquanto a síntese de RNA de sucesso tem sido relatado para oligómeros não modificados de RNA de nucleótidos ao longo do comprimento de 100, o máximo prático e económico para a síntese de RNA personalizado está abaixo de 40 nucleótidos. No entanto, qualquer dada sequência pode ser sintetizado e a introdução orientada dos nucleótidos modificados (por exemplo, desoxirribonucleótidos) pode ser utilizada para analisar locais de clivagem em detalhe. Mais longos de pré-CRNAs deve ser gerada através de transcrição in vitro. O recozimento de oligonucleótidos que contêm um promotor de ARN-polimerase de T7 permite a produção de comprimento intermédio pré-CRRNComo. O comprimento máximo de rotina e economicamente oligonucleótidos de ADN sintetizadas está apenas acima de 150 nucleótidos e representa o máximo de síntese pré-crRNAs através deste método. A montagem dos vários pares de oligonucleótidos de ADN hibridados que formam extremidades coesivas com o outro pode estender este comprimento máximo mas necessita desafios crescentes na clonagem do construto. A principal vantagem deste método é a capacidade para gerar pré-crRNA construções (e, portanto, Cas endonuclease substratos) com qualquer sequência desejada. Isto permite que o teste de modelos crRNA sintéticos. Finalmente, os pré-crRNAs maiores podem ser obtidos a partir de PCR amplificados de elementos genómicos CRISPR inteiras ou fracções dos mesmos. Alterações ao modelo in vitro de transcrição do plasmídeo pode ser introduzido, através de mutagénese dirigida para a produção de pré-crRNA variantes. Estas construções podem ser usadas para analisar o padrão de clivagem endonucleolítica mundial dentro de um inteiropré-crRNA. O trabalho pioneiro para a produção de ARN não modificado através de T7 RNA polimerase de transcrição in vitro foi baseada em RNAs de transferência 14 e do vírus do mosaico brome RNA 15. O consenso do promotor T7 RNA polimerase consiste de um domínio de reconhecimento (-17 a -5) e um domínio de iniciação (-4 através +6) com o início da transcrição em um guanosina essencial um 16. Posições jusante de um pode ser variada o que permite a transcrição de quase qualquer sequência de ARN desejado. Os métodos apresentados para a geração de modelos in vitro run-off de transcrição permitir a síntese in vitro de completos pré-crRNAs que correspondem regiões genômicas CRISPR ou sintéticos pré-crRNA variantes. As transcrições são gerados com um presente trifosfato 5&#39;-terminal, a menos que a reacção de transcrição é iniciada com GMP para se obter 5 &#39;monofosfato de terminais 14. Esses terminais são necessários se as transcrições devem ser rotuladoscom polinucleótido-quinase de T4 e γ-[32 P]-ATP. A actividade de clivagem de Cas6 e Cas6 enzimas semelhantes gera crRNA que contêm 5&#39;-hidroxilo e um grupo 2 &#39;, 3&#39;-terminais cíclicos fosfato. Estes RNAs podem então ser analisados ​​para o reconhecimento pelo complexo de cascata.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Antártida Fosfatase </td><td> NEB </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> Transcrição in vitro de grau Ultrapure Trisfosfatos Nucleotide </td><td> Jena Bioscience </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> Cromatografia líquida, ktapurifier 100 </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Os oligonucleótidos de DNA </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oligonucleotídeos de RNA </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Purification Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Rotação Miniprep Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> Kit Plasmid Maxi </td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> NEB </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> NEB </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> Ligase de ADN de T4 </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> Quinase de polinucleótido T4 </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerase </td><td> própria preparação </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mix Solução desoxinucleotídeo </td><td> NEB </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> Mini-PROTEAN Sistema de Electroforese Tetra </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> Scanner Tempestade 840 </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> Armazenamento Phosphorscreen </td><td> Molecular Dynamics </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> Mono Q 5/50 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion DNA polimerase de alta fidelidade </td><td> NEB </td><td> M0530L </td><td> usar o tampão GC </td></tr><tr><td> Azul de Toluidina </td><td> Sigma </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> NEB </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32 P]-ATP, α-[32 P]-ATP </td><td> Hartmann Analítica </td><td> SRP-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems

A interação do vírus e seus hospedeiros procarióticos moldaram a evolução da vida de bactérias e Archaea. Procariotos desenvolveram várias estratégias para evitar ataques virais que incluem a modificação restrição, infecção abortiva e CRISPR / Cas sistemas. Estes sistemas adaptativos imunes encontrados em muitas bactérias e mais Archaea consistem em c Abrilhantado r i egularly nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) e um número de sequências de C RISPR como associada (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Conjuntos diferentes de proteínas Cas e repete definir pelo menos três grandes tipos divergentes de CRISPR / Cas sistemas 4. As proteínas e universais CAS1 CAS2 são propostas a serem envolvidas na absorção do DNA viral quegerará um elemento espaçador entre duas repetições na extremidade 5 &#39;de um cluster CRISPR estendendo 5. O conjunto inteiro é transcrito em um precursor crRNA contendo todos espaçador e sequências de repetição e é posteriormente processado por uma enzima da família Cas6 diversificada em crRNAs menores 6-8. Estes consistem crRNAs da sequência flanqueada por um espaçador 5 &#39;terminal (8 nucleótidos) e um 3&#39; terminal de tag derivada da sequência de repetição 9. A infecção repetida do vírus pode agora ser bloqueada como o crRNA novo será dirigido por um complexo de proteína Cas (Cascade) para o ADN virai e identifica-o como tal através da complementaridade de base 10. Finalmente, para CRISPR / Cas tipo 1 sistemas, o CAS3 nuclease vai destruir o invasor detectado ADN 11,12. Esses processos definem CRISPR / Cas como um sistema imune adaptativo de procariotas e aberto um campo de pesquisa fascinante para o estudo das proteínas envolvidas Cas.A função de muitas proteínas Cas ainda é evasivo e as causas da aparente diversidade dos sistemas CRISPR / Cas continuam a ser iluminado. Atividades potenciais da maioria das proteínas Cas foram previstos através de análises detalhadas computacionais. A maior fracção de proteínas Cas ou são mostrados ou propostas para funcionar como endonucleases 4. Aqui, apresentamos métodos para gerar crRNAs e precursor-CRNAs para o estudo da endoribonucleases Cas. Os ensaios de endonucleases diferentes requerem sequências de repetição ou curtas que podem ser directamente sintetizados como oligonucleótidos de ARN ou sequências mais crRNA e pré-crRNA que são geradas in vitro por meio de polimerase de ARN de T7 a transcrição run-off. Esta metodologia permite a incorporação de nucleótidos radioactivos para a produção de substratos de endonuclease internamente marcadas e da criação de crRNAs sintéticos ou mutante. Cas6 actividade endonuclease é utilizado para pré-crRNAs amadurecer em crRNAs com 5&#39;-hidroxilo e um 2 &#39;, 3&#39;-terminais cíclicos fosfato.

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Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

CRISPR / Cas sistemas mediato imunidade adaptativa em Bacteria e Archaea. Muitas proteínas Cas são propostos para agir como endoribonucleases actuam sobre precursores crRNA de comprimento variável. Aqui, ilustramos três abordagens diferentes para gerar pré-crRNA substratos para a análise bioquímica da actividade de endonuclease Cas.

Geração de substrato para Endonucleases de CRISPR / Cas Sistemas

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Usando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desenvolver ferramentas de diagnóstico

Biologia

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of cells (approximately 25 in C. borealis) which are well characterized. The cells in the STG exhibit a broad range of outputs and are responsible for the motor actions of the stomach. The stomach contains the gastric mill which breaks down food with three internal teeth, and the pylorus which filters the food before it reaches the midgut. The STG produces two rhythmic outputs to control the gastric mill and pylorus known as central pattern generators (CPGs). Each cell in the STG can participate in one or both of these rhythms. These CPGs allow for the study of neuromodulation, homeostasis, cellular and network variability, network development, and network recovery.
The dissection of the stomatogastric nervous system (STNS) from the Jonah crab (Cancer borealis) is done in two parts; the gross and fine dissection. In the gross dissection the entire stomach is dissected from the crab. During the fine dissection the STNS is extracted from the stomach using a dissection microscope and micro-dissection tools (see figure 1). The STNS includes the STG, the oesophageal ganglion (OG), and the commissural ganglia (CoG) as well as the nerves that innervate the stomach muscles. Here, we show how to perform a complete dissection of the STNS in preparation for an electrophysiology experiment where the cells in the STG would be recorded from intracellularly and the peripheral nerves would be used for extracellular recordings. The proper technique for finding the desired nerves is shown as well as our technique of desheathing the ganglion to reveal the somata and neuropil.

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric nervous system (STNS) of the Jonah crab (C. borealis) can be used for electrophysiology, immunohistochemistry, and cell culture studies. The STNS extraction is done in two parts: the gross and fine dissection.

Câncer Borealis Dissection Sistema Nervoso Stomatogastric

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissecação bruta do Estômago da lagosta, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Geração de humanos CD40-activated células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Síntese e calibração de nanossondas Phosphorescent for Imaging Oxigênio em Sistemas Biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

Ensaios biofísicos para investigar as propriedades mecânicas do núcleo da célula Interphase: Aplicação de substrato Strain e Manipulação de microagulhas

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...