Name: substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems
Uploaded: 2012-09-08T17:00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems at JoVE.com

Författarna vill tacka Jeanette Schermuly för beredning av rekombinant T7 RNA-polymeras och Norman Ebelt för hjälp att förbereda Figur 1. Detta arbete har finansierats av medel från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) och Max Planck-sällskapet.

1. Generering av långa före crRNA substrat via PCR <ol><li> Design PCR-primers inriktade på distans regioner i ett CRISPR kluster. Lägg T7 RNA-polymeras (T7RNAP) promotorsekvens (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) med den främre primem och restriktionsställen för kloning av PCR-produkten in i en vektor för båda primrar (t.ex. BamHI och Hind III för pUC19, Fig.. 2A) . Obs! T7RNAP kräver en guanidin rest för korrekt initiering av transkription. </li><li> Amplify din pre-crRNA sekvens av intresse från genom-DNA med PCR. </li><li> Separera PCR-produkterna genom agarosgelelektrofores och gel extrahera den önskade bandet. Digerera PCR-produkten med restriktionsenzymerna att skapa klibbiga ändar (t ex BamHI och Hindlll, fig.. 2A). Rena din PCR-produkt med en PCR-reningskit att eliminera klyvning biprodukter. </li><li> Inrätta en ligeringsreaktion som innehåller T4 DNA-ligas, T4-DNA-ligasbuffert ochett 3:1 molförhållande av den spjälkade PCR-produkten och den defosforylerade linjära pUC-vektor med motsvarande klibbiga ändar. Inkubera blandningen vid 16 ° C över natten. Omvandla ligeringsblandningen till kompetenta Escherichia coli DH5a-celler genom standardprotokoll och använda blå vit screening för att identifiera framgångsrika ligering. </li><li> Isolera plasmider från vita kolonier med en plasmid förberedelse kit. Identifiera positiva kloner av plasmid sekvensering. Alternativt kan koloni-PCR användas för screening. </li></ol> 2. Generering av intermediär före crRNA substrat genom glödgning av DNA-oligonukleotider <ol><li> Designa framåt och bakåt oligonukleotider med önskad CRISPR upprepning / distans sekvens. Oligonukleotiderna innehåller sekvensen av en T7-RNAP-promotor samt terminala restriktionsställen (t.ex. BamHI och Hindlll för pUC19). Avsluta oligonukleotiderna att klibbiga ändar form efter glödgning (se figur. 2B </sTrong&gt;). </li><li> 5&#39;-fosforylera 1 nmol av varje oligonukleotid i en separat 20 | il reaktion innehållande 5 pl T4 polynukleotidkinas (PNK), 2 pl T4-PNK 10x buffert, 2 pl ATP (10 mM). Inkubera varje prov under 1 timme vid 37 ° C. </li><li> Hybridisera de två fosforylerade oligonukleotiderna. Kombinera 1 pl av den fosforylerade framåt oligo blandning (från 2,2.), 1 pl av den fosforylerade omvända oligo blandning (från 2,2.), 1 pl T4 DNA-ligas 10x buffert i en 10 pl reaktion. Inkubera proverna under 5 min vid 95 ° C på ett värmeblock eller i kokande vatten, stäng av värmekällan och låt blandningen svalna till rumstemperatur (~ 2-3 timmar). Obs: I denna kritiska steg, gynnar den långsamma kylningsprocessen annealing av de två oligonukleotiderna jämfört med bildningen av strukturer inom varje enskild oligonukleotid. </li><li> Ligera 4 pl av hybridiseringsblandning, 1 pl av digererad och defosforylerad pUC-vektor (0,1 pg /il) med T4 DNA-ligas, T4 DNA-ligas 10x buffert och 10 mM ATP i en 20 pl ligeringsblandning. Inkubera provet vid 16 ° C över natten. </li><li> Förvandla de ligerade plasmidema in i kompetenta Escherichia coli DH5a-celler genom standardprotokoll och använda blå vit screening. Isolera plasmider och identifiera positiva kloner genom digerering (för att screena för skär av önskad storlek) och efterföljande plasmiden sekvensering. </li></ol> 3. Generering av korta Cas RNA-substrat genom anpassade RNA-oligonukleotidsyntes Design kort Cas RNA-substrat (t.ex. enstaka upprepade sekvenser, Fig.. 2C) och använda anpassade RNA anläggningar oligonukleotidsyntes. Obs: Införandet av en deoxiribonukleotid vid en specificerad position en RNA-oligonukleotid (figur 2C) kan användas för att lokalisera platsen för RNA-spaltning. 4. In vitro T7 RNA-polymeras transkription <ol><li> Isolera plasmider med utformad konstruktion (från 1,9. Eller 2,7.) Med en maxiprep plasmidrening kit. </li><li> Linjärisera plasmiden med restriktionsenzymet som klyver nedströms det klonade fragmentet (t.ex. Hindlll). Säkerställa fullständig digerering. Obs: Om en divergerande definierad 3-änden av RNA-transkriptet önskas bör den utformas konstruktionen innehålla en ytterligare specifik restriktionsställe för &quot;run-off&quot; transkription uppströms Hindlll-sekvensen. </li><li> Rena den lineariserade plasmiden genom fenol: kloroform (1:1) extraktion och etanolutfällning. Återvinna de nukleinsyror genom resuspendering av pelleten i DEPC behandlat sterilt vatten. </li><li> Inrätta en in vitro-T7-RNAP avrinning transkription blandning som innehåller 40 mM Hepes / KOH (pH 8), 22 mM MgClj, 2 5 mM ditiotreitol, 1 mM spermidin, 4 mM av varje nukleosidtrifosfat ATP (, CTP, GTP, UTP ), 40-100 pg / ml av digereradplasmid och 0,1 mg / ml T7-RNAP i DEPC-behandlat vatten. Inkubera under 3 timmar vid 37 ° C. </li><li> Analysera de erhållna RNA-transkript på en denaturerande 8 M karbamid 12% polyakrylamidgel (fig. 3A). RNA-transkript kan renas genom Mono Q-anjonbyteskromatografi 13 och utvanns genom etanolutfällning av RNA-fraktioner och återsuspension av pelleten i DEPC-behandlat sterilt vatten. För framtida bruk, förvara RNA vid -80 ° C. </li></ol> 5. Cas6 endonukleas-analys <ol><li> Inrätta en 20 pl in vitro T7-RNAP avrinning transkription blandning (se 4,4) som innehåller en reducerad mängd av 2 mM ATP och kompletteras med 2,5 pl α-[32 P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Rena reaktionsprodukter genom gel-extraktion från en denaturerande 8 M karbamid 12% polyakrylamidgel. Visualisera band genom autoradiografi. </li><li> Producera och rena de önskade rekombinanta Cas-proteiner. I detta exempel CAS6 från Clostridium thermocellum renades via värme fällning och Ni-NTA-kromatografi. </li><li> Inrätta en reaktion endonukleas-analys (t.ex. för Clostridium thermocellum Cas6, innehåller reaktionsblandningen 20 mM Hepes (KOH pH 8), 250 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 12.000 cpm RNA-substrat och 1 pM enzym och inkuberades vid 37 ° C under 30 minuter). </li><li> Fyll 5 pl av reaktionsblandningen (+ 10 | il RNA-laddningsbuffert innehållande 95% formamid) på en 8 M urea 12% polyakrylamidgel. Visualisera sönderdelningsprodukterna efter elektrofores genom autoradiografi. </li></ol> 6. Representativa resultat Ett exempel på RNA-substrat för analys av Cas endonukleasaktivitet visas i figur 3A. En alikvot av 5 pl av en analytisk 100 pl in vitro transkriptionsreaktion laddades. Observera att effektiviteten av RNA-produktion varierar mellan olika konstruktioner. Vissa faktorer thatt observerades att påverka mängden erhållna RNA är (i) den första sekvensen efter +1 G krävs för transkriptionsinitiering, (ii) möjligheten av RNA strukturbildning under transkription och (iii) val av restriktionsstället för generering av avrinningen klyvning läge. Undersökningen av RNA endonukleasaktivitet kräver både högrenade rekombinanta Cas proteiner (Fig. 3B) och ordentliga negativa kontroller. Idealt, skiljer sig detta negativt kontrollprov så lite som möjligt från den undersökta CAS endonukleas reaktion. Detta kan åstadkommas genom inkubering av RNA med reaktionsbuffert och cell-lysat utan Cas expressionen (och efter det identiska reningsförfarandet). En idealisk negativ kontroll är tillsatsen av en deoxiribonukleotid på det föreslagna klyvningsstället. I fig 3C, är klyvning av en märkt 5 &#39;terminala upprepningssekvens visas för Clostridium thermocellum Cas6. Enligt<html> identiska förhållanden är denna upprepning inte ett substrat längre när en deoxiribonukleotid införs i position -9. Denna metod ger också information om klyvningsstället. Slutligen är en lång internt märkt före crRNA klyvs av Cas6 och två klyvning fragment observeras. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> Figur 1. Schematisk översikt över CRISPR / CAS aktivitet. Översikten följer införandet av en viral DNA-sekvens (protospacer) i CRISPR klustret (anpassning), transkriptionen och bearbetning av CRISPR arrayen i små crRNAs med Cas6 endonukleas, upptaget av crRNAs i Cascade komplexa och inblandning av en upprepade virusangreppet baserad på komplementaritet mellan crRNA och protospacer. Protospacer intilliggande motiv (PAM) mark virala protospacer sekvenser. igure 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. Generering av RNA-substrat för Cas-proteiner. Systemet visar arbetsflödet för att generera (A) lång pre-crRNA substrat (B) mellanliggande före crRNA substrat och (C) kort Cas RNA-substrat för pre-crRNA produktion. Exempel sekvenser presenteras för CRISPR mängd Clostridium thermocellum. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> Figur 3. Cas6 endonukleas analys. A.) Toluidinblå färgad polyakrylamidgel av ett skräddarsytt RNA-oligonukleotid (250 pmol) och två in vitro-RNA-transkript (5 pl av en typisk 100 | il reaktion). B.) SDS-PAGE-gel av ett Cas6 preparat (80 pmol) från Clostridium thermocellum efter värmeutfällning vid 50 ° C under 1 timme och Ni-NTA-kromatografi. C) Påvisande av endonukleolytisk Cas6 aktivitet för 5-terminal märkt upprepade sekvenser och före crRNA in vitro-transkript. Införandet av en dNTP vid position -9 upphäver Cas6 klyvning för en kort Cas RNA-substrat (S, fig. 2C). En 5 &#39;terminal 8 nt taggen är också skapas för crRNA mognad från långa pre-crRNA substrat (L, figur. 2A). Banden separerades på en denaturerande 8 M karbamid 12% polyakrylamidgel och visualiserades genom autoradiografi.

<ol>
	<li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li><li>Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+RNA-interference-based+immune+system+in+prokaryotes:+computational+analysis+of+the+predicted+enzymatic+machinery,+functional+analogies+with+eukaryotic+RNAi,+and+hypothetical+mechanisms+of+action.">A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action.</a> Biol. Direct. 1, 7 (2006).</li><li>Lillest&#248;l, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+viral+defence+mechanism+in+archaeal+cells.">A putative viral defence mechanism in archaeal cells.</a> Archaea. 2, 59-72 (2006).</li><li>Makarova, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).</li><li>Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li><li>Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+and+cleavage+of+CRISPR+RNA+by+Cas6.">Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6.</a> RNA. 16, 2181-2188 (2010).</li><li>Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-+and+structure-specific+RNA+processing+by+a+CRISPR+endonuclease.">Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.</a> Science. 329, 1355-1358 (2010).</li><li>Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+maturation+of+effector+RNAs+in+a+CRISPR+interference+pathway.">Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).</li><li>Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas6+is+an+endoribonuclease+that+generates+guide+RNAs+for+invader+defense+in+prokaryotes.">Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes.</a> Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).</li><li>Wiedenheft, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+RNA-guided+surveillance+complex+from+a+bacterial+immune+system.">Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system.</a> Nature. 477, 486-489 (2011).</li><li>Garneau, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468, 67-71 (2010).</li><li>Sinkunas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas3+is+a+single-stranded+DNA+nuclease+and+ATP-dependent+helicase+in+the+CRISPR/Cas+immune+system.">Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system.</a> EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).</li><li>Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono+Q+chromatography+permits+recycling+of+DNA+template+and+purification+of+RNA+transcripts+after+T7+RNA+polymerase+reaction.">Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction.</a> Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).</li><li>Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+physical+characterization+of+an+unmodified+yeast+phenylalanine+transfer+RNA+transcribed+in+vitro.">Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).</li><li>Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+viral+RNAs+synthesized+in+vitro+show+altered+aminoacylation+and+replicase+template+activities.">Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities.</a> Nature. 311, 171-175 (1984).</li><li>McGinness, K. E., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+ribonucleotides+in+the+T7+RNA+polymerase+promoter+element.">Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element.</a> J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

De presenterade metoderna möjliggör generering av Cas endonukleas substrat för olika storleksområden och med varierande frihet i sekvens design. Den mest rättfram metod för generering av syntetiska RNA oligonukleotid substrat är begränsad till korta RNA mönster på grund av ökande kostnader och tekniska begränsningar för att skapa längre RNA-oligomerer. Medan framgångsrika RNA-syntes har rapporterats för omodifierade RNA oligomerer på över 100 nukleotider långa, ligger det praktiska och ekonomiska maximum för anpassade RNA-syntes under 40 nukleotider. Emellertid kan vilken given sekvens syntetiseras och den riktade införandet av modifierade nukleotider (t.ex. deoxyribonukleotider) kan användas för att analysera klyvningsställen i detalj. Längre pre-cRNAs ska skapas genom in vitro transkription. Annealing av oligonukleotider som innehåller en T7-RNA-polymeras-promotor möjliggör produktion av mellanliggande längd före CRRNSom. Den maximala längden för rutinmässigt och ekonomiskt syntetiserade DNA-oligonukleotider är precis över 150 nukleotider och representerar den maximala av syntetiska före-crRNAs via denna metod. Montering av ett flertal par hybridiserade DNA-oligonukleotid som bildar klibbiga ändar med varandra kan utvidga denna maximala längd men kräver ökande utmaningar i kloning av konstruktionen. Den huvudsakliga fördelen med denna metod är förmågan att generera förväg crRNA konstruktioner (och därför CAS endonukleas substrat) med någon önskad sekvens. Detta medger testning av syntetiska crRNA mönster. Slutligen kan större pre-crRNAs erhållas från PCR amplificates av hela element genomiska CRISPR eller fraktioner därav. Förändringar av in vitro transkription mall plasmiden kan införas genom riktad mutagenes för generering av pre-crRNA varianter. Dessa konstruktioner kan användas för att analysera det globala endonukleolytisk klyvning mönster inom ett heltpre-crRNA. Det pionjärarbete för produktion av omodifierat RNA genom T7 RNA-polymeras in vitro transkription baserad på transfer-RNA 14 och Brome mosaikvirus RNA 15. Den konsensus T7 RNA-polymeras-promotor består av en igenkänningsdomän (-17 till -5) och en inledande domän (-4 till +6) med transkriptionsinitiering vid en väsentlig guanosin en 16. Positioner nedströms på +1 kan varieras som medger transkription av nästan varje önskad RNA-sekvens. De presenterade metoder för att generera in vitro run-off transkription mallar möjliggör in vitro-syntes av kompletta pre-crRNAs som matchar genomiska CRISPR regioner eller syntetiska pre-crRNA varianter. Transkripten genereras med en 5&#39;-terminal trifosfat närvarande inte transkriptionsreaktion primas med GMP för erhållande 5 &#39;termini monofosfat 14. Sådana terminaler krävs om utskrifterna ska märkasmed T4-polynukleotidkinas och γ-[32 P]-ATP. Klyvning aktivitet av Cas6 och Cas6-liknande enzymer genererar crRNA som innehåller 5&#39;-hydroxyl-och en 2 &#39;, 3&#39;-cyklofosfat ändar. Dessa RNA kan sedan analyseras för igenkänning av Cascade komplexet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> Antarktis Phosphatase </td><td> NEB </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> in vitro transkription Grade ultrarent nukleotidtrifosfater </td><td> Jena Bioscience </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> Vätskekromatografi, ktapurifier 100 </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DNA-oligonukleotider </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RNA-oligonukleotider </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28.704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Purification Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28.104 </td><td></td></tr><tr><td> Spin Miniprep Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 27.106 </td><td></td></tr><tr><td> Plasmid Maxi Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 12.163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> NEB </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> Hindlll </td><td> NEB </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA-ligas </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> T4 polynukleotidkinas </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA-polymeras </td><td> egna förberedelser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxinukleotid Blanda </td><td> NEB </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> Mini-Protean Tetra elektroforessystem </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> Storm 840 Scanner </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 163.723 </td><td></td></tr><tr><td> Lagring Phosphorscreen </td><td> Molecular Dynamics </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> Mono Q 5/50 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion hög Fidelity DNA-polymeras </td><td> NEB </td><td> M0530L </td><td> använda GC-buffert </td></tr><tr><td> Toluidinblå </td><td> Sigma </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> NEB </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32 P]-ATP, α-[32 P]-ATP </td><td> Hartmann Analytic </td><td> SRP-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems

Samspelet mellan virus och deras värdar prokaryota formade utvecklingen av bakterier och archaeal liv. Prokaryoter utvecklat flera strategier för att kringgå virusangrepp som inkluderar begränsning modifiering, misslyckad infektion och CRISPR / Cas-system. Dessa adaptiva immunsystem finns i många bakterier och de flesta arkéer består av c lustered r egularly jag nterspaced s hort p alindromic R EPEAT (CRISPR) sekvenser och ett antal C-RISPR som intresseföretag (CAS) gener (Fig. 1) 1-3. Olika uppsättningar av Cas proteiner och upprepar definierar minst tre större olika typer av CRISPR / Cas-system 4. De universella proteinerna CAS1 och CAS2 föreslås vara inblandade i upptaget av virus-DNA somkommer att generera en ny distanselement mellan två upprepningar vid 5 &#39;terminalen av en utsträckt CRISPR kluster 5. Hela klustret transkriberas till en prekursor-crRNA innehållande alla distansorgan och sekvenser upprepning och därefter bearbetas av ett enzym av olika Cas6 familjen i mindre crRNAs 6-8. Dessa crRNAs består av distansorganet sekvensen flankerad av en 5 &#39;-terminal (8 nukleotider) och en 3&#39;-terminal tag härledd från upprepningssekvensen 9. En upprepad infektion av viruset kan nu blockeras som ny crRNA kommer att regisseras av en Cas proteinkomplex (Cascade) till viralt DNA och identifiera den som sådan via bas komplementaritet 10. Slutligen, för CRISPR / Cas typ 1-system kommer nukleas Cas3 förstöra detekterade inkräktaren DNA 11,12. Dessa processer definierar CRISPR / Cas som ett adaptivt immunförsvar prokaryoter och öppnade en fascinerande forskningsområde för studier av de inblandade Cas proteiner.Funktionen av många Cas proteiner är fortfarande svårfångad och orsakerna till den uppenbara mångfalden av CRISPR / Cas-system återstår att belysas. Potentiella aktiviteter flesta Cas proteiner förutspådde via detaljerade beräkningsmetoder analyser. En stor del av Cas proteiner antingen visas eller föreslås fungera som endonukleaser 4. Här presenterar vi metoder för att generera crRNAs och utgångsmaterial-cRNAs för att studera Cas endoribonucleases. Olika endonukleas analyser kräver antingen korta upprepade sekvenser som direkt kan syntetiseras som RNA-oligonukleotider eller längre crRNA och pre-crRNA sekvenser som genereras genom in vitro-T7 RNA-polymeras avrinning transkription. Denna metod gör det möjligt att inkorporering av radioaktiva nukleotider för generering av internt märkta endonukleas substrat och skapandet av syntetiska eller mutant crRNAs. Cas6 endonukleasaktivitet används för att mogna före crRNAs i crRNAs med 5&#39;-hydroxyl och en 2 &#39;, 3&#39;-cyklofosfat ändar.

Watch this Scientific Journal Video about Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems at JoVE.com

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

CRISPR / CAS-system förmedlar adaptiv immunitet i bakterier och arkéer. Många Cas proteiner föreslås att fungera som endoribonucleases verkar på crRNA prekursorer av varierande längd. Här illustrerar vi tre olika metoder för att generera före crRNA substrat för biokemisk analys av Cas endonukleasaktivitet.

Substrat för skapandet endonukleaser av CRISPR / CAS Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Använda Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) för att utveckla diagnostiska verktyg

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

Cancer Borealis Stomatogastric nervsystemet Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Gross Dissection i magen av Hummer, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Generation of Human CD40-activated B cells

Generering av Human CD40-aktiverade B-celler

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Kvantitativa Phosphoproteomics i Fatty Acid Stimulerade Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescens Aktiverade cellsortering för växt Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Syntes och kalibrering av Phosphorescent Nanoprobes för Oxygen Imaging i biologiska system

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Fönster på en mikrovärld: Enkel mikroflödessystem system för att studera mikrobiella transport i porösa material

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Biofysiska analyser för att undersöka mekaniska egenskaper Interphase cellkärnan: grundmaterial Sila Ansökan och Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Användning av kemostater i Microbial Systembiologi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...